PD-1-PD-L1信号通路阻断剂的研究复习课程.ppt

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1、PD-1/PD-L1信号通路阻断剂的研究报告人：张杰指导导师：张双全教授11.前言2.立题依据和意义6.已有进展5.进度安排4.研究设想及方法开题报告3.国内外研究进展2立题依据及意义PD-L1(B7-H1)属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用；该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明其与肿瘤的免疫逃逸机制相关。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，且表达广泛，表达的PD

2、-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。转染PD-L1基因的P815肿瘤细胞系在体外可抵制特异性CTL的裂解，将其接种小鼠体内后具有更强的致瘤性和侵袭性。这些生物学特性均可通过阻断PD-L1而逆转。敲除PD1基因的小鼠，阻断PD-L1/PD-1通路，则接种肿瘤细胞不能形成肿瘤。通过阻断PD-L1/PD-1信号通路可有效抑制肿瘤生长，可根据此设计新的对肿瘤免疫逃逸的治疗方案，来加强T细胞对肿瘤的杀伤作用。4国内外研究进展-PDL1在肿瘤中的表达PD1（programmeddeath-1）最初是在凋亡的T细胞杂

3、交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。目前，PD-1的配体被证实有两个，分别是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC).PD-L1蛋白广泛表达于抗原提呈细胞（APCs）、活化T、B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，且许多癌组织较正常组织中的PD-L1表达水平明显上调。应用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到PD-

4、L1蛋白的表达，且PDL1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。5国内外研究进展-PD1/PDL1在肿瘤免疫治疗中的作用在抗肿瘤免疫中，通常遵循肿瘤特异性T细胞活化、T细胞增值、肿瘤浸润和T细胞记忆应答加强的步骤。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APCs表达的PD-L1均可经PD-1/PD-L1信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答。因此，干预PD-1/PD-L1信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。PD-L1单抗能有效抑制局部肿瘤生长；阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细

5、胞的增值，发挥杀伤肿瘤细胞的作用；阻断肿瘤细胞上相关PD-L1信号可上调浸润CD8T细胞IFN-R的分泌，表明PD-1/PD-L1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥作用；选择抗PD-L1单抗配合肿瘤疫苗进行肿瘤免疫治疗可有效加强肿瘤疫苗的免疫激活作用，减弱肿瘤微环境对疗效的影响；6研究设想及方法7研究设想及方法表达可溶性PD1与肿瘤细胞上过度表达的PDL1结合；利用单链抗体库筛选与PDL1特异性结合的SCFV；利用多肽库筛选与PDL1特异性结合的多肽；SCFV或多肽阻断PD1/PDL1通路机理的研究

6、；8PD-L1/PD-1相关蛋白的表达鉴定已有报道PD-1和PD-L1在原核中以包涵体形式表达，为了获得可溶性的PD-1和PD-L1；我们拟采用sumo标签融合表达PD-1和PD-L1，以期获得可溶性表达；镍柱纯化，sumo酶酶切，再镍柱纯化获得与天然氨基酸相同的PD-1和PD-L1；以备单链抗体及多肽的筛选实验；采用酵母表达系统来表达纯化PD1-IgG，来阻断PD-1/PD-L1通路；9PDL1的单链抗体SCFV的筛选利用噬菌体展示技术从高容量半合成人抗体文库中筛选PDL1的特异性的且具有封闭PDL1生物学活性的单链抗

7、体片断(scFv)；采用酵母表达系统来表达纯化SCFV-FC，来研究是否能阻断PD-1/PD-L1通路；利用SCFV与PDL1的高亲和力，研究能否融合毒素靶向杀伤高表达PDL1蛋白的肿瘤细胞；10PDL1特异性结合多肽的筛选利用NEB7/12-mer多肽文库；筛选与PDL1特异性结合的多肽；研究其与PDL1的结合能力，能否与其受体PD1竞争性结合的能力；能否成开发成为一种阻断PD1/PDL1信号通路的多肽药物；11SCFV或多肽阻断PD1/PDL1通路机理的研究T细胞活力的增强：流式细胞仪检测活化状态T细胞(CD44+)

8、的数量是否增加；细胞因子数量的增加：ELISA检测IFN-r、IL-10等细胞因子的表达量是否提高；肿瘤位置T细胞数目的增加：免疫组化方法检测活化T细胞是否在肿瘤位置聚集以发挥其杀伤作用；12进度安排研究生一年级上学期：专业课的理论学习；研究生一年级下学期：阅读大量的专业文献，获取PD1/PDL1基因；研究生二年级上