附件3 免疫荧光法（IFA）检测人血清IgG抗体.doc

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1、附件3免疫荧光法（IFA）检测人血清IgG抗体试验材料：（1）抗原片：家鼠型和姬鼠型汉坦病毒标准毒株感染VeroE6或Vero细胞制备，低温干燥保存；（2）阳、阴性对照：单克隆抗体或确诊阳性患者恢复期血清（阳性对照）、阴性血清；（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光抗体；（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；（5）荧光显微镜。检测步骤：（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1:20开始做2倍或4倍连续稀释至需要的稀释度。（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加

2、入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30～40分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）。（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。（6）荧光显微镜观察结果。结果判断：细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4

3、个“+”。可参考阳性细胞数：<25%为“+”，25%～50%为“++”，51%～75%为“+++”，>75%为“++++”；无特异性荧光者为“—”（阴性）。检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（>“+”）最高血清稀释度的倒数表示。意义：阳性结果，表明曾受到汉坦病毒感染，>1：20有诊断参考意义；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。