分子荧光分析法课件.ppt

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1、第五章分子荧光分析法荧光自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同波长和不同强度的光，一旦外界能源消失，则这种光也随之消失，这种光称为荧光。外界提供能量的方式有多种，如光照、加热、化学反应及生物代谢等。通过光照激发产生的荧光称为光致荧光。根据激发光的波长不同，荧光可分为Ｘ射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光等。根据发射荧光的粒子不同，荧光又可分为分子荧光和原子荧光。由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同，测量物质的荧光

2、强度可对其进行定量测定。荧光分析法（fluorescenceanalysis）就是利用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。荧光分析法的特点是灵敏度高、选择性好、样品用量少和操作简便。它的灵敏度通常比分光光度法高2～3个数量级。在卫生检验、环境及食品分析、药物分析、生化和临床检验等方面有着广泛的应用。第一节基本原理一、荧光的产生物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15s），成为激发单重态分子

3、。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态。1.振动驰豫这一过程只能发生在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。2.内转换即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。3.荧光较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8s，称作荧光寿命），以光辐射形式放出能量，回到基态各振动

4、能级，这时所发射的光称为荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态。4.系间窜跃有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了。5.磷光经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-4～10s，称作磷光寿命），然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振

5、动能级，这时发出的光称为磷光（phosphorescence）。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长。二、激发光谱和荧光光谱（一）荧光的检测光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。（二）激发光谱与荧光

6、光谱的形成任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitationspectrum)和荧光发射光谱(fluorescenceemissionspectrum)。1.激发光谱保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。2

7、.荧光光谱荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。（三）荧光光谱与激发光谱的关系1.荧光光谱形状与激发光波长无关由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射，与分子被激发至哪一个电子激发态无关。2.荧光光谱比激发光谱波长为长由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁（振动驰豫、内转换）损

8、失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振动能级，再由此发出荧光。因此，荧光发射能量比激发光能量低，荧光光谱波长比激发光波长长。3.镜像对称对于高度对称的有机分子，其荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。解释1