细胞工程2培养细胞常规检查和特性鉴定课件.ppt

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1、第一章　绪论4个学时第二章　实验室配置及基本技术2个学时第三章植物细胞工程的理论基础4个学时　第四章　植物组织器官培养技术6个学时第五章　植物细胞培养及次生代谢产物生产3个学时第六章　原生质体培养和体细胞杂交3个学时第七章　人工种子及植物种质资源保存2个学时第八章　　胚胎干细胞培养2个学时第九章　　动物细胞培养4个学时第十章　　动物细胞融合与单克隆抗体4个学时　　　第十一章　动物组织与胚胎工程1个学时　　　　　　第十二章　试管动物与克隆动物1个学时课程初步安排：36学时第八章动物细胞培养

2、第一节动物细胞体外培养方法第二节体外培养动物细胞的生物学特性第三节培养细胞常规检查和特性鉴定第四节动物细胞的低温保存第五节细胞同步化第六节器官培养（自学）第三节培养细胞常规检查和特性鉴定一、培养细胞常规检查（一）肉眼观察培养物颜色及混浊度（二）倒置显微镜观察细胞生长状态（三）培养细胞的污染检测和排除二、细胞系的鉴定（三）培养细胞的污染检测和排除培养细胞的污染：混入培养环境中对细胞生长有害的成分和造成细胞不纯的异物，包括：－微生物（真菌、细菌、病毒和支原体）－化学物质（影响细胞生存非细胞所需的化学成分）－细胞

3、（非同一种的其他细胞）常见微生物污染。微生物污染包括细菌、酵母菌、霉菌和病毒污染。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境以及品质良好之细胞来源和培养基严格无菌配制是减低污染之最好方法。1、微生物污染及其排除微生物污染的途径微生物污染对细胞的影响微生物污染的检测微生物污染的防治a.空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。b.器材：培养器皿、器械，CO2培养箱。c.操作：无菌观念不强。d.血清：质量不好、检查不严。e.组织样本：避免用

4、碘消毒。由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗菌素的抗污染能力也有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。1）一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如果能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。2）当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞质出现较多的颗粒状物质；较重者细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现了大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。3）不同微生物污染物对细胞的影响也有差别，支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期

5、、缓慢和潜在的；霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或是产生有毒物质杀灭细胞。真菌的污染真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一般肉眼可见。短期内培养液多不混浊。倒置显微镜下可见在细胞间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝悬浮飘荡在培养液中。高倍镜下可见到很多菌丝有链状排列的菌珠，念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。细菌污染细菌的污染较为多见是大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌等。加

6、用抗菌素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。一旦发生易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现明显混浊现象。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在。细胞生长停止并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液向肉汤细菌培养基内滴加，37％下培养检测是否污染。Fungus支原体污染支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2um）并独立生活的微生物。约有1％可通过滤菌器。无细胞壁，

7、形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，在光镜下不易看清内部结构。支原体污染以后多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间。培养液可不发生混浊，多数情况下，细胞病理变化轻微且可由于传代、换液而缓解，易被忽视；个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养皿脱落。确定有无支原体污染可做如下检测：相差显微镜检测、荧光染色法、电镜检查、DNA分子杂交检查等。培养细胞的污染一旦明确，多数将无法救治，如果污染的细胞不是具有重要价值，一般发现污染后应尽快弃之，以防污染扩大影响其它细胞。防止污染关键在于严格无菌操作，为防止污染和抢救

8、有价值的细胞，目前一般可采用一下措施：（1）抗生素（2）加温处理（3）动物体内接种细胞系特征及细胞系间交叉污染的测定同工酶分析血型及主要组织相容性抗原的测定G显带技术DNA分析二、细胞系的鉴定细胞系组织来源的鉴定具有特征性标志的超微结构分析免疫学试验测定细胞骨架蛋白组织特异性抗原的鉴定细胞特殊功能的生化检查方法细胞来源及特征数据的计算机化第四节动物细胞的低温保存细胞的冷冻保存是细胞培养实验室的常用方法。细胞冻存与