细胞工程培养细胞的生长增殖过程ppt课件.ppt

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1、培养细胞的生长增殖过程第四节一体外培养细胞的生长增殖过程原代培养期:从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。传代期：从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。1.原代培养（PrimaryCulture）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但

2、不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2．传代期初代培养细胞一经传代后便改称

3、做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（DiploidCellLine）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。初代培养细胞系（连续细胞系）老化传代期0

4、2468101214周16141210863．衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续

5、细胞系（ContinuousCellLine）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。二培养法培养瓶培养法培养板培养法A培养瓶培养法所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅

6、酸玻璃。形状主要采用适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。与此相关的一种方法是盖玻片+培养瓶培养，就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。这样具有以下几优点：。(1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。(2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。（3）增加了培养瓶的培养面积。B培养板培养法培养板培养法曾被称为微量培养法，是现代体外培养技术最为常用的方法之一。具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用的培养

7、板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。三原代培养技术幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。任何动物细胞培养均从原代培养开始。原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养原代培养包括：取材、分散细胞、接种、培养等．在所有操作中，多都要注意保持培养物及生长环境的无菌条件。组织块培养组织块的原代培养方法，首先从机体某部位取下组织，方法：处死动物将组织块剪碎Hanks液冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液吹打、低速离心、弃上

8、清液、留下组织块吸管取出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养液培养传代组织块也可用两只手术刀片将组织块切碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间长，容易污染。对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。组织消化培养1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间质较少的软组织。2、培养过程：处死动物----将组织块剪碎Hanks液冲下剪刀上的碎块