药物分析一化实验.doc

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1、药物分析一体化实验克霉唑的合成、含量测定和最低抑菌浓度MIC的测定一、实验目的1、掌握克霉唑的性状、化学性质和药理作用。2、掌握格氏反应的原理及基本操作。3、进一步巩固重结晶的原理和实验方法。4、熟悉高效液相色谱的原理和操作。5、熟悉并掌握抗菌药物的最小抑菌浓度MIC的检测方法。二、实验原理（一）克霉唑的合成克霉唑为白色或无色结晶性粉末。溶于无水乙醇、丙酮和氯仿，几乎不溶于水，纯品熔点142~145℃。克霉唑是广谱抗真菌药物,特别是对真菌的深度感染有较高疗效。克霉唑的合成主要以邻氯苯甲酸为初始原料，通过酯化反应、格氏反应、氯化、缩合而制得。格氏

2、反应是一个发生在金属表面的非均相反应。电子从金属原子向反应基质RX的转移使反应开始，所生成的自由基阴离子由于其碳-卤键较弱而分解成一个自由基R﹒和一个X-，然后自由基再与镁反应。在克霉唑的合成过程中，首先在对甲苯磺酸的催化下，邻氯苯甲酸与乙醇发生酯化反应。然后生成的邻氯苯甲酸乙酯与格式试剂发生缩合反应得到含酮类化合物，再通过水解反应得到二苯基-（2'-氯苯基）甲醇（缩合物）。生成的醇与氯化亚砜进行分子内的亲和取代反应，最后与咪唑缩合反应生成克霉唑。反应式：（二）克霉唑的含量测定克霉唑在紫外光260nm下有最佳吸收波长，本实验采用高效液相色谱法外

3、标法室温检测。高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。（1）输液泵：①流量稳定；②流量范围宽；③输出压力高；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。（2）进样器：一般HPLC分析常用六通进样阀，六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。（3）色谱柱：色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。（4）检测器：HPLC的检测器分为两类①通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化；②专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的

4、变化。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。（三）克霉唑的抗菌实验霉唑属吡咯类抗真菌药，具广谱抗真菌活性，对白念珠菌则可抑制其自芽孢转变为侵袭性菌丝的过程。作用机制：该品通过干扰细胞色素P-450的活性，从而抑制真菌麦角固醇等固醇的生物合成，损伤

5、真菌细胞膜并改变其通透性，以致重要的细胞内物质外漏;可抑制真菌的甘油三脂和磷脂的生物合成;也可抑制氧化酶和过氧化酶的活性，引起细胞内过氧化氢积聚导致细胞亚微结构变性和细胞坏死。白色念珠菌所致的皮肤念珠菌病和外阴阴道炎，由红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和犬小孢子菌所致的体癣、股癣、足癣和糠秕马拉色菌所致的花斑癣，也可用于治疗甲沟炎、须癣和头癣。三、实验试剂及仪器试剂：乙醇、邻氯苯甲酸、对甲苯磺酸、碳酸氢钠、氯仿、镁、碘、无水乙醚、溴代苯、稀硫酸、氯化钙、甲苯、活性炭、石油醚、无水丙酮、霉唑重结晶产物、克霉唑对照品（100037）、甲醇（色谱

6、）等琼脂粉、改良马丁培养基、二甲亚砜、白色念珠菌仪器：真空抽气泵、旋转蒸发仪、三用紫外线分析仪、电子天平、真空干燥箱、电动搅拌器、红外灯、高效液相色谱、全自动酶标仪、台式恒温振荡器、SW-CJ-2FD洁净工作台、DH3600B电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、PL403电子天平、超纯水系统、试管、烧杯、量筒、刻度吸管、圆底烧瓶、锥形瓶、培养皿、细胞培养板、新华1号滤纸、EP管、接种环、枪头、移液枪等四、实验内容（一）克霉唑的含量测定1、邻氯苯甲酸乙酯的生成在250mL干燥的三口烧瓶上，依次配置搅拌器、油浴锅和带有CaCl2干燥管的回流冷凝管。

7、向三口瓶中加入1g邻氯苯甲酸和对0.189g甲基苯磺酸,4.5g无水乙醇，待溶解后，将温度调至78℃，保持此温度，然后搅拌回流带水12h。向三口瓶中加入足量的饱和碳酸氢钠溶液并充分搅拌，然后加入适量的氯仿并搅拌。测定上层溶液PH应大于等于7，下层溶液PH应等于7。取下层溶液作为反应液，并将反应液转移至分液漏斗中进行萃取。分取下层溶液旋蒸除尽溶剂，得到液状产物，产物呈淡黄或浅黄绿色。计算收率。2、二苯基-（2'-氯苯基）甲醇（缩合物）的生成在250ml干燥的四口瓶中，依次配置搅拌器、油浴锅和带有CaCl2干燥管的回流冷凝管及温度计。向四口瓶中加入

8、0.215g镁和0.019g碘,0.7g无水乙醚，室温下缓慢滴加溴代苯1.942g-乙醚0.8g，缓慢搅拌使溶液混合，滴加完毕后升温至56-70℃回流