生物样品的处理方法课件.ppt

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1、第五章药物定量分析与分析方法验证第五章药物定量分析与分析方法验证第一节定量分析样品的前处理方法第二节定量分析方法的特点第三节药品分析方法的验证第四节生物样品分析方法的基本要求第五章药物定量分析与分析方法验证生物样品分析的特点1．干扰物质多——生物样品中含有大量的内源性物，如质蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析——样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析2．样品量少、不能重复取样——生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样3．被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高第五章药物定量分析与分析方法验证1.检测方法的高灵敏度—最低

2、检测量10-9~10-7g或10-15~10-12g2.分离方法的高选择性、高专属性为满足各项要求，最常用的分析方法有1）色谱法——GC、HPLC、HPCE（high-performancecapillaryelectrophoresis）2）免疫分析法——RIA、EIA3）联用技术——GC-MS、LC-MS体内分析方法要求（1）去除蛋白质(血样)①加与水混溶的有机溶剂—蛋白质分子内和分子间氢键发生改变.(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)②加中性盐—蛋白质脱水.(饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等)③加强酸—与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀(

3、10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)④加含锌盐及铜盐的沉淀剂—与蛋白质阴离子形成不溶性盐沉淀.(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)⑤酶解法—枯草菌溶素.适用于酸不稳定及蛋白结合牢固药物.第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法（2）缀合物的水解(尿样)含羟基、羧基、氨基和巯基药物+葡萄糖醛酸→葡萄糖醛酸苷缀合物含酚羟基、芳胺和醇类药物+硫酸→硫酸酯缀合物第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法常用方法:酸水解:盐酸酶水解:葡萄糖醛酸苷酶硫酸酯酶葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶第五章药物定量分

4、析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法（3）分离纯化与富集①液-液萃取法水相pH值是萃取成功的关键水相最佳pH值碱性药物：高于pKa值12个pH单位酸性药物：低于pKa值12个pH单位第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法但生物样品宜在碱性或近中性提取——生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性(pH13)下提取液的杂质峰最少第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法空白血清乙醚提取物的HPLC

5、色谱图第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法②液-固提取法（固相萃取法）原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法(4)化学衍生化化学衍生化目的①使药物变成具有能被分离的特性②提高对样品的检则灵敏度③增加药物的稳定性④提高对光学异构体的分离能力第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法（5）有机破坏

6、方法：湿法破坏干法破坏氧瓶燃烧法第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法湿法破坏常用试剂：硝酸或硝酸-高氯酸.特点：破坏能力强、反应激烈，无机金属离子为高价态.应用：适用于血、尿、组织等生物样品的破坏.第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法高温炉高温破坏应用——适合人发样品的破坏干法破坏第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理生物样品的处理方法氧瓶燃烧法应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上60℃烘干,按规定折叠后固定.人发：洗净、干燥（60℃~80℃）剪碎,称取0.

7、1~0.3g置无灰滤纸,按规定折叠固定.生物样品的处理方法第五章药物定量分析与分析方法验证-样品前处理第五章药物定量分析与分析方法验证生物样品定量分析方法验证内容与基本要求1．特异性——避免干扰2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围3．准确度——与实际状况相符4．精密度——结果可重现5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/206．稳定性——确保所有样品准确测定7．提取回收率——确保准确度18一、方法特异性方法的特异性(specificity)——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用——系指当有内源性物质存在时，方法准

8、确测定待测物质的能力专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(