《生物样品的预处理》PPT课件

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1、生物样品的预处理江南大学医药学院初级分离阶段PrimaryseparationPrimaryseparation的任务分离细胞和培养液破碎细胞释放产物溶解包含体复原蛋白质浓缩产物去除大部分杂质生物样品的预处理不同来源样品分离的预处理植物组织提取物的制备动物组织提取物的制备细菌中重组蛋白的提取制备细胞的破碎与分离常见的方法细胞破碎技术的发展方向1不同来源样品分离的预处理样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织提取液等。生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素等，

2、因此对目标组分进行初步富集和分离，对干扰组分进行初步去除等工作都属于预处理。生物样品特征：目标产物浓度普遍较低，悬浮液大部分是“水”，组分复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物；分离过程很容易发生失活现象，pH、离子强度、温度等变化常常造成产物的失活；性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。分离过程注意点迅速加工，缩短停留时间控制好操作温度和pH减少和避免与空气接触受污染的机会总体设计好各组分的分离顺序不同来源样品分离的预处理1.1植物组织中活性物质的提取1

3、.1.1酶的提取植物组织中所存在的酚类化合物使植物中提取酶的过程变得复杂。植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应,使目的酶失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。酚类化合物与蛋白质的结合方式可逆结合酚类化合物的两个羟基与蛋白质分子形成氢键，例如肽键的CO端和NH端不可逆结合酚类化合物的两个相邻羟基被氧化为邻苯醌之后，通过共价键与蛋白质分子中的自由氨基以及巯基结合引起蛋白质活性基团集合，引起聚集、交叉结合和沉淀（酶促褐变作用）预处理需要注意：温度尽可能低提取液

4、的量要保证“充分浸入”加入足量酚类吸附剂加入足量氧化酶抑制剂搅拌转速要恰当pH要控制在合适范围，一般5.5～7酚类吸附剂的种类：天然和合成的聚合物清蛋白尼龙粉聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）通过-CO-N=与酚羟基形成氢键聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）聚乙烯和聚丙烯树脂，如离子交换树脂XAD-2、-4和-7聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（Bio-RadAG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和阳离子交换树脂（Dowex-50）表面疏水，易吸附带疏水基团的化合物酚氧化酶抑制剂抗氧化剂：2-巯基乙醇，二硫苏糖

5、醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE)，抗坏血酸盐前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除剂抗坏血酸盐能阻止醌重新还原成酚，在低浓度的醌存在下就很易被消耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用（50mmol/L）1.1.2RNA的提取从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。Northern杂交分析、纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库、RT-PCR及差示分析等过程中需要高质量的RNA能否有效地去除多糖、酚类化合物、萜类化合物RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。酚类化

6、合物与RNA不可逆结合导致RNA活性丧失、用苯酚或氯仿抽提时RNA丢失、形成不溶性复合物多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀萜类化合物和RNase会造成RNA的化学降解和酶解酚类化合物的干扰及对策还原剂法2-巯基乙醇(ME)、二硫苏糖醇（DTT）或Cys来防止酚类物质被氧化，硼氢化钠（NaBH4）是可还原醌的还原剂螯合剂法PVP和PVPP中的-CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强Tris-硼酸法硼酸可与酚类靠氢键形成复合物，抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合牛血清白

7、蛋白（BSA）法原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会丙酮法用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。多糖的干扰及对策植物组织往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，对RNA提取造成较大的干扰。对策：SDS-盐酸胍处理；

8、高浓度Na+或K+离子下，苯酚、氯仿抽提；低浓度乙醇沉淀多糖；醋酸钾沉淀多糖。蛋白杂质的影响及对策蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规方法：冷冻条件下研磨植物材料以抑制R