生物样品预处理技术课件.ppt

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1、生物体内药物分析选论生物体内样品及其预处理技术生物体内药物分析的特点常规药物分析：原料药物和药物制剂分析真伪鉴别、纯度检查、含量测定共存杂质、制剂辅料、复方药物生物体内药物分析：复杂生物样品的微量分析药物浓度低样品采量少干扰成分多研究对象血样尿液唾液胆汁组织器官预处理方法分离纯化浓集实验结果测定动物实验方法学考察和验证样品前处理样品分析数据处理具体考虑生物体内药物分析的研究对象即生物体内样品，则需要从生物样品来源、样品种类和检测组分三方面来讨论。1.生物样品来源：决定于研究的目的人体与动物2.生物样品种类：如体液、器官、组织和排泄物等

2、3.检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等生物样品来源临床前吸收试验组织分布试验代谢排泄毒代动力学临床临床药代动力学制剂生物利用度及生物等效性生物样品种类生物样品种类选取的一般原则：（1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；（2）易于获得；（3）便于处理，适合于分析；（4）根据不同目的与要求进行选取。生物样品种类可分为均匀生物样品：血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体液呼出气体非均匀生物样品：心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织粪便排泄物生物样

3、品种类检测组分即生物样品中的药物及其代谢物等（1）原形药物的测定；（2）游离药物的监测；（3）活性代谢产物的监测；（4）药物对映体的监测；（5）作用部位药物浓度的测定；（6）体内内源性物质的测定。一、生物样品的一般处理原则生物样品贮存生物样品均匀化结合物水解生物基质的性质测定对象的性质一、生物样品的一般处理原则生物样品的贮存采集哪种生物样品：血浆、血清、全血、尿、组织…血浆酯酶引起的水解——血浆样品—加入酯酶抑制剂微生物导致的腐败——尿液样品—加入防腐剂冷藏储存条件–20℃：大部分药物–80℃：阿莫西林等抗生素加稳定剂：卡托普利等立即

4、测试：维生素C等一、生物样品的一般处理原则生物样品均匀化体液样品：尿液、血浆——涡旋混匀固体样品：组织、粪便——加入适量溶剂进行高速匀浆一、生物样品的一般处理原则结合物水解Ⅱ相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物极性大、亲水性、不易于提取富集酸水解：简便、快速，不具备专一性，注意药物是否被破坏酶水解：β-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时间长，实验费用高二、生物样品预处理方法预处理的目的：去蛋白，释放药物样品纯化和富集满足分析方法灵敏度的需要防止分析仪器的污染和劣化满足大量样品分析的需要微量、快速二、生物样品预处理方法常用的

5、生物样品预处理方法沉淀蛋白液液萃取液固提取二、生物样品预处理方法沉淀蛋白操作：50μl血浆＋150μl甲醇→涡旋1min→3500rpm离心10min→取上清液进样分析常用沉淀剂：与水能混溶的有机溶剂——甲醇、乙腈酸性沉淀剂——三氯醋酸、高氯酸二、生物样品预处理方法应用中注意问题：去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱柱和仪器的影响色谱峰形液质联用分析中的基质效应检测灵敏度是否足够二、生物样品预处理方法液液萃取操作：血浆＋一定体积萃取溶剂→振荡/涡旋萃取3～5min→3500rpm离心10min→取上清液氮气下吹干→流动相复溶后进样分

6、析溶剂的选择与纯度的要求有机溶剂相和水相的体积水相的pH值二、生物样品预处理方法常用的液液萃取溶剂：正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇*相似相容原理进行选用沸点低、易于挥散和浓集不易乳化、不影响紫外检测体积选择依实验考察极性增加二、生物样品预处理方法水相的pH值水相pH值主要由药物的pKa确定对于碱性药物最佳pH值要高于pKa值1～2个pH单位对于酸性药物要低1～2个pH单位碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取血浆加入1MNaOH进行碱化后用适合溶剂提取二、生物样品预处理方法液液萃取的优点：选择性高便于纯化和富集操作方

7、便对仪器的污染小缺点：易产生乳化操作费时，不易于自动化二、生物样品预处理方法液固提取固相萃取超声提取——对于固体生物样品，如粪便，组织等，匀浆处理后，用合适的有机溶剂进行液固萃取，涡旋振荡提取或者超声提取，上清液吹干或者进行第二次液液萃取，以便进一步的纯化富集二、生物样品预处理方法固相萃取操作：活化上样淋洗洗脱收集直接进样或者浓缩后进样与色谱理论相同二、生物样品预处理方法二、生物样品预处理方法采用离心或者抽真空的办法，以一定离心力或者流速，进行上样、淋洗和洗脱二、生物样品预处理方法固相萃取的优点：无乳化现象使用溶剂安全价格低廉萃取效

8、率高处理速度快，具有一定通量易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性强的Ⅱ相代谢产物MCX固相萃取柱反相作用和阳离子交换作用酸性环境中含氮碱性基团与磺酸基结合酸性药物呈分子状态发生反相结合作用示例不同生物样品中虎杖苷