《生物样品前处理》PPT课件

《《生物样品前处理》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、现代生化分离技术SeparationMethodsinBiochemistry第二章生物样品前处理2第二章生物样品前处理第一节样品分离的预提取第二节细胞的破碎与分离第一章绪论3第二章生物样品前处理第一节样品分离的预提取（前处理）前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进行去除；2.1.1概述预处理材料的种类和特点动物细胞反应液植物细胞反应液微生物细胞反应液植物组织提取液动物组织提取液“发酵液”“产物”，胞内or胞外？组织4第二章生物样品前处理2.1.2植物组织提取物的制备植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。叶片、根、茎——清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4°C

2、——-30°C低温保存备用）；种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等——泡涨，粉碎。5第二章生物样品前处理一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。2.1.2.1植物组织中酶的提取6第二章生物样品前处理例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1.步骤：100g新鲜叶片→切成小片（打孔器、切片）→置入提取液中（稳定酶活性）→PVPP预

3、浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）→间歇高速搅拌（充分接触混匀）→纱布过滤→滤液加入PVPP重复轻搅（重复一次）→离心去除PVPP→酶粗提液。7第二章生物样品前处理2.条件讨论低温（4～5度），器皿、溶液预冷、操作要快；5～7倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）；PH6.5~7.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点；PVPP优良，不溶性；PPO抑制剂，DTT、2-ME；蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。8第二章生物样品前处理2.1.2.2多糖提取重要活性多糖步骤：原料→粉碎→醇醚回流脱脂→水提取→粗提液去蛋白

4、策略：Sevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性TCA法，低浓度的TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。9第二章生物样品前处理2.1.2.3细菌重组蛋白的提取重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。10第二章生物样品前处理例：E.coli.中提取重组蛋白1.步骤：酶解菌体细胞：离心收集菌体→溶菌酶→去核酸（DNaseⅠ）→电泳检测；清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；溶解包涵体：释放目的蛋白；目的蛋白再折叠：恢复活性11第二章生物样品前处理第二节细胞的破碎与分离微生物代谢产物：胞外产

5、物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）胞内产物（大多数蛋白质、类脂）微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。2.2.1概述12第二章生物样品前处理2.2.2常用破碎方法机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等；对物料的挤压和剪切作用非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；13第二章生物样品前处理2.2.2.1珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝d<1mm

6、）一起快速搅拌，细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。玻璃珠（石英砂、氧化铝等研磨剂）+细胞悬浮液→研磨→释放胞内物14第二章生物样品前处理破碎过程产生热能，要注意热交换，温度控制——夹套冷却，实验室预冷器皿；适用于绝大多数微生物细胞的破碎高破碎率，但难以实现固液分离，浆状特点：15第二章生物样品前处理高压匀浆器；细胞悬浮液受高压作用→快速从针形阀射出→经历剪切、碰撞、高压至常压变化后导致细胞壁和细胞膜的破坏→释放胞内物2.2.2.2高速匀浆法原理16第二章生物样品前处理特点增大压力和破碎次数，对于高浓度的细胞或难破碎的细胞常采用多次循环操作的方法3

7、0～60Mpa最佳易造成堵塞的团状或丝状真菌不适合较小的革兰氏阳性菌（细胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不适合17第二章生物样品前处理2.2.2.3超声破碎法可听波（次：地震、海啸）20~20KHz（超）。空化现象指超声波在传播过程中与组织中的气核或微气泡相互作用，使其突然爆破，产生巨大的瞬间压力，从而改变组织结构的现象。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎工作原理18第二章生物样品前处理适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加冷水）工作频率25～130KHz功率正比于破碎效果细胞浓度低有利于空化泡的形成及爆破，破碎