流式抗体及荧光染料的选择课件.ppt

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1、流式抗体及荧光染料的选择陈晓东产品技术专员抗原抗体反应12流式抗体的选择、荧光染料应用2珈源医学抗原抗体反应抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的特点影响抗原抗体反应的因素3珈源医学抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。抗原与抗体的特异性结合既会在体内发生，亦可以在体外进行，体外进行的抗原抗体反应习惯上称作血清学反应抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合抗原抗体之间的结合力亲水胶体转化为疏水胶体物质基础4珈源医学抗原抗体反应的特点特异性可逆性比例性阶段性5珈源医学特异性：抗原与抗体结合反应的专一性抗原抗体反

2、应特异性示意图分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性6珈源医学可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性影响因素：抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合越牢固，越不易解离环境因素对复合物的影响－pH、离子强度7珈源医学前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalencezone)：抗原抗体比例合适抗原抗体反应比例性示意图比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系8珈源医学阶段性第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见第二阶段：反应可见阶段，反应慢，

3、出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象9珈源医学影响抗原抗体反应的因素一、反应物自身因素抗原:理化性状、表位种类和数目抗体:来源、特异性、亲和性、效价二、环境因素电解质:生理盐水或缓冲液酸碱度:pH6～pH9（pH7.2～pH7.4）温度:15℃～40℃（4℃），37℃最适10珈源医学流式抗体的选择、荧光染料应用11珈源医学RUOASRIVDⅡ类体外诊断试剂分析物特异性试剂仅用于研究12珈源医学单克隆抗体混合单克隆抗体多克隆抗体荧光直标的抗体未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进行间接标记检测）单分子荧光素复合分子荧光素13珈源医学信噪比（S/N）：特异性荧光信号（

4、signal）与非特异性荧光信号的比值PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCPS/N越大，表明阳性与对照细胞的荧光峰分离越好，当S/N大于3时属于可接受范围14珈源医学综合因素：荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（E/P比值）也会影响相对荧光强度。抗体检测的抗原密度：高密度的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和何阴性细胞群的目的。细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC）

5、可以得到较好的S/N比值。15珈源医学理想荧光素具有高的光子产量，信号强度高对激发光有较强的吸收，降低背景信号激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物得特异性稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响16珈源医学17珈源医学18珈源医学根据仪器选用荧光素：1.每个通道只能选择1种荧光素2.各个通道之间的荧光素可以随意搭配搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小19珈源医学注意：1.不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说明书减半量甚至更多进行标记。2.不能完全凭感觉进行标记，需进行细

6、胞计数。3.应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为FITC的荧光特性是pH依赖的。4.荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露于强光下。5.建议尽快上机检测（最好24h内）。20珈源医学ThankYou!陈晓东产品技术专员21珈源医学