如何选择合适的流式抗体.doc

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1、.如何选择合适的流式抗体？？？随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。如何从众多的流式厂商中筛选出最适合您的抗体，优宁维交给您方法：第一：满足所需抗体的基本要求（抗原、识别种属、能用于流式实验）①目标蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，确定检测指标； ②识别种属：严格按照样本种属来源进行选择，流

2、式抗体基本无法进行种属交叉反应； ③可用于流式实验,说明书中明确标注经FC实验测试，最好有实验数据图和用量说明；在查询抗体时 这三要素是抗体查询必需填写项，下面是正确示范案例图1（参考优宁维官网高级查询）流式微信公众号：流式专家或UNIV-FCMsolutionWord资料.图1第二：确定流式细胞仪的配置（激光器+探测器）图2任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱：第一个是激发光谱（Excitation，Ex）：–是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。–吸收波峰（最大吸收波长）。第二个是

3、Ex-Max发射光谱（Emission）：–是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。–发射波峰（最大发射波长）：Em-Max发射波峰--最大发射波长。（如图2）那么荧光素跟我们的流式抗体选择有什么关系？Word资料.  在设计流式配色方案前，根据可能需要同时检测指标的多少，先确定需要在哪台流式细胞仪上机检测，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息： ①激发器：常见的流式细胞仪有405，488nm和635nm三个激光器，不同流式仪器激光器配置不同，但有些机器在购买时只装了一个激光器，需要注意的是，型号

4、相同的机器也未必激光配置相同;激光器是跟荧光素的激发波长相关，所选择荧光素一定是流式仪器激光激发范围内的。 ②滤光片：也就是有流式仪器上几个检测通道，这决定了最多可以同时检测多少个指标；荧光素的发射波长是跟滤光片有关，发射波长一定是要在流式仪器的检测范围之内。③仪器的具体型号：再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测有时候检测通道也是不一样的。比如BDCalibur是双激光四色，配置的激光器和能够检测的通道详细如下（表1）：激光器检测通道滤光片配置滤光片检测发射波长在检测范围之内的荧光素488FL1BP

5、530/30515-545FITC、AF488、GFPWord资料.FL2BP585/42564-606PEFL3670LP﹥670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP661/16653-669APC、AF647表1第三：荧光抗体的选择建议  流式检测的抗体必须要求都有荧光标记，在选择过程中可参考以下几方面建议①荧光标记：流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。间接标记二抗会增加实验步骤，清洗多次造成细胞浪费，会影响实验的准确性，所以在流式实验过程中，为了尽量减少实验工序和过程，以保证实验的

6、真实和准确性，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。②高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”Word资料.的荧光素分配给表达低的抗原：荧光本身有强弱之分，可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光PE；反之，抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光FITC即可（常用荧光强弱排序为：PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC）；更多荧光素的强弱比较如图3，stainindex（SI）染色指数越高，荧光素越强。Word资料.图3比如：Treg的检

7、测常用指标是CD4，CD25和FOXP3，CD4表达较多，所以使用不太亮的荧光素FITC，CD25和FOXP3表达较低，所以使用较强的荧光素APC和PE，配色如下CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE第四：流式多色分析荧光搭配的原则很多实验需要同时检测多个指标，比如同时检测CD3CD4CD8IFN-gammaIL-4Word资料.等，就需要给每个指标搭配不同的荧光素以便分析，多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配，需要考虑多种因素，怎么能够非常好的搭配呢？优宁维公司有如下建议供大家参考：①每个检测通道只能选择

8、一种荧光素：各通道之间的荧光素可以随意搭配（比如使用仪器是calibur，在进行双标实验时，FL1选择了FITC标记的抗体，就不能再选择AlexaFluor488标记的抗体；而同组实验的其余抗体选择PE或者APC标记，都是可以随意组合的）；②选择光谱重叠小的染料：由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。多色流式实验的时