实验二十叶绿素含量的测定.doc

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1、实验二十叶绿素含量的测定叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。方法Ⅰ一、目的掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。二、原理叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a、b在652nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a、b的总量。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。2.仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25m

2、l容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。3.试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。四、实验步骤1.叶绿素的提取称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。2.测定取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652nm波长下读取吸光度（A）值。五、计算将测得的吸光度A

3、652值代入公式(1),即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg·g－1Fw）。A652C(mg·ml－1)=————……………………………………………………（1）34.5公式中：C—叶绿素（a和b）的总浓度(mg·ml－1)A652—表示在652nm波长下测得叶绿素提取液的吸光度34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm,样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。C（mg·ml－1）×提取液总量（ml）叶绿素含量（mg·g－1Fw）=————

4、————————————……（2）样品鲜重（g）方法Ⅱ一、目的掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。二、原理叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a.、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb……………………(1)A645=16.75Ca+45.6Cb……………………(2)（1）、（2）式中的A663.A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。Ca、

5、、Cb为叶绿素a、b的浓度，单位为mg·L－1。82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm下的比吸收系数。16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm下的比吸收系数。解（1）、(2)式联立方程，得：Ca=12.70A663–2.69A645……………………(3)Cb=22.9A645–4.68A663……………………(4)CT=Ca+Cb=20.21A645+8.02A663……………………(5)Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度,CT为总叶绿素浓度，单位：（mg·L－1），.利用上面(3)、（4）、（5）

6、式可以分别计算出叶绿素a、b及总叶绿素浓度。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片2.仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。3.试剂：80﹪乙醇。四、实验步骤1.叶绿素的提取从植株上选取有代表性的叶片数张（除去粗大叶脉）剪碎后混匀，快速称取0.2g(可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪乙醇10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，

7、用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。2.测定取光径为1cm的比色杯，加入叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇作为对照，分别于663nm及645nm波长下测定吸光度（A）值。五、结果计算将测定得到的吸光度A663、A645值分别代入上面(3)、(4)、（5）式计算出Ca、Cb及CT(即叶绿素a、b及叶绿素总量浓度)。再按下式计算出叶绿素a、b及叶绿素总含量。Ca×提取液总量(ml)叶绿素a含量（mg·g－1Fw）=—————————————样品鲜重（g）×1000Cb×提取液总量(ml)叶绿素b含量（

8、mg·g－1Fw）=————————————－样品鲜重（g）×1000CT×提取液总量(ml)叶绿素总含量（mg·g－1Fw）=————————————－样品鲜重（g）×1000最后计算出叶绿素a/叶绿素b的比值，并加以分析。一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的