叶绿素含量的测定

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1、实验二.叶绿素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。一.实验原理叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。叶绿素a、b在长

2、波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：D663=82.04Ca+9.27CbD645=16.75Ca+45.6Cb(浓度单位：g/mL）CA=12.72D663–2.59D645CB=22.88D645–4.68D663CT=20.29D645+8.02D663(浓度单位：mg/L）二.试剂与材料2.1试剂：丙酮、石英砂、碳酸钙2.2材料：水稻、玉米、花生、桑树等植物的新鲜叶片。2.3仪器与器皿：分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管三.实验步骤1．取样：清洗叶片并擦

3、干,称取0.5g叶片，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少乙醇或丙酮向环境中的排放，故不设重复）。注意取样时要避开大的叶脉。2．研磨提取：向研钵中加入96%乙醇或80%丙酮2ml，以及少许CaCO3(中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素)和石英砂，研磨成匀浆，至组织变白，在暗处静止3-5min后，用滤纸过滤到25ml容量瓶中。注意：用滴管吸取96%乙醇或80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用96%乙醇或80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用96%乙醇或80%丙酮定容至刻度。3．读取吸光度：取厚

4、度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有96%乙醇或80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、646、470nm处，以96%乙醇或80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次

5、在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。4．结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。叶片洗净、吸干、去大叶脉↓称0.5g叶用乙醇或丙酮研磨↓匀浆过滤（用乙醇或丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）↓滤液用乙醇或丙酮定容至25mL↓置分光光度计测定(注意:不同提取溶剂波长不同)四.结果计算4.1结果计算C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数Chl=(mg/g叶)材料

6、鲜重（g）4.2比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同种植物在不同生长环境下Chla/Chlb差异。五.注意事项注意叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高可进行适当稀释注意分光光度计的规范使用六.思考题为什么植物在不同生长环境下其Chl含量有差异？Chla/Chlb有何适应意义？