角毛壳菌生物防治相关基因的筛选.pdf

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1、!（(!）*+*,*+%中国生物防治R304FPF;QH4/1;IY0;1;50:/1R;4=H;1!""&年7月角毛壳菌生物防治相关基因的筛选张海燕，杨谦!（哈尔滨工业大学生命科学与工程系，哈尔滨*7"""*）!"#"$%&’(’)*&’$’(%+’#,+"#-%"./"("0)+’1!"#$%&’()’*)+,$)’?@)AB@/0$6/4，C)ABD0/4（EFG/H=.F4=;IJ0IFK:0F4:F/4LMF:34;1;56，@/HN04O4P=0=Q=F;IMF:34;1;56，@/HN04*7"""*，R304/）关键词：角毛壳菌；:EA)文库；表达序列标签；生物防

2、治；相关基因中图分类号：K%&#；D&’#文献标识码：)文章编号：*""7$+!#（*!""&）"!$"*+*$"%采用环保的生物防治技术取代传统的化学防治技术已经在植物病害防治领域中达成共识［*］。角毛壳菌（!"#$%&’()’*)+,$)’）属于子囊菌亚门毛壳菌属，是一种有效的生物防治菌［!］，对一些常见的植物病原菌的防治效果好，例如：粉红镰刀菌（-).#,()’,&.$)’）、苹果黑星菌（/$0%),(#(0$1)#2(.）、稻梨孢（34,(*)2#,(#&,45#$）、灰葡萄孢（6&%,4%(.*(0$,$#）等［(］。用角毛壳菌制成的生物药剂对尖孢镰刀菌（-7&84.+&

3、,)’）菌丝生长抑制率可达到’%9!%S，盆栽试验防治效果也很好［%］。角毛壳菌的生物防治机制主要是拮抗作用、重寄生作用、产生毒素类或抗生素类物质、促进植物的生长、引起寄主植物的抗性。国内外对角毛壳菌的研究较少。作为一种生物防治菌，角毛壳菌可能具有一些较为独特的生理过程。本文从研究角毛壳菌的基因为出发点，通过构建菌丝体时期的:EA)文库，随机挑选出若干个克隆进行-KMP序列测定并进行生物信息学分析，得到与生物防治相关的基因。现将结果报道如下。2材料和方法232菌体的制备角毛壳菌由本实验室保存，取其孢子悬液接种到TE培养液中，!&U，*%"HV.04振荡培养#"3，然后收集角毛壳菌的

4、菌丝体，纱布过滤，保存在,’"U冰箱中备用。234主要试剂MH02;1试剂（B0N:;）；.WA)提取试剂盒（D0/5F4）；质粒快速提取试剂盒（D0/$5F4）；E-TR试剂（K05./）；D0/

5、口或国产分析纯试剂。#5V#1235总678和1678的提取纯化取"975角毛壳菌菌丝体提取总WA)。菌体在液氮中研磨成粉末，转至装有MH02;1试剂的7".1离心管混匀；分别用酚V氯仿抽提，异丙醇沉淀，&7S乙醇洗涤；少量E-TR水溶解。提取纯化采用.WA)提取试剂盒，具体操作按说明书进行。收稿日期：!""#$"%$"&基金项目：国家’#(高技术项目（!""())!%**%"）作者简介：张海燕（*+&&,），女，博士生，-$./01：23/4536*7"8*!#9:;.；!通讯作者，博导，-$./01：6/45<0/4’%83;=./01>:;.。*+*中国生物防治第R;卷!"#

6、$%&’文库的构建以!"#$为模板，利用%&’()*+),’-!逆转录酶合成+.#$的一链，以+.#$一链为模板在.#$聚合酶"（/012#3）的指导下合成+.#$双链，用45.#$聚合酶补平，然后与!"#$"接头连接。收集大于6007’的+.#$片段与载体’8%连接，电转化。转化后的细胞在%9:培养基中重悬，在;6<、/;0)2!,=条件下振荡培养5>!,=，然后将细胞均匀涂抹在经过?@AB3和CD4A处理的含有氨苄青霉素（$!’）的E8平板，;6<过夜培养。次日查看文库的克隆数，通过蓝白斑数量确定重组率。随机从文库中挑取克隆以46和4;引物作D:"扩增，电泳鉴定插入片段大小，评

7、价文库的质量。!"()*+,序列的测定和聚类分析随机挑选克隆转至含有>!3F4培养基的GH孔板中培养过夜，采用质粒快速提取纯化试剂盒提取纯化质粒后，以4;作测序引物从+.#$片段的>’端利用I(JB8B*(/000测序仪（$*K!()DB)’KB!,B，8,L-(+K）进行序列测定。测序完成得到M%4*序列，用DK)(N软件读取峰图文件将其转化为碱基序列文件；然后应用:)L**!B-+K程序屏蔽掉载体序列。提取高质量的大于/007’的M%4*序列，利用DK)B’程序进