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1、应用酶联免疫吸附技术检测食品农药残留民以食为天，随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食品的质量安全要求也逐渐提高。随着全球经济一体化发展和贸易国际化，食品安全问题已延伸为全球性公共问题。尤其是近年来，食品安全事件大量发生，严重影响了大众对社会的看法。所以，综合考虑食品对经济效益和社会效应的影响，如何确保食品的安全性成为食品行业面临的重要课题。药物残留分析从20世纪50年代就开始应用,至今经历了气相色谱法、高效液相色谱法、高效薄层色谱法、超临界流体色谱法、毛细管区域电泳法和免疫分析法。药物残留
2、分析是复杂的混合物中痕量组分的分析技术,既需要精细的微量操作手段,又需要高灵敏度的痕量检测技术,难度大、仪器化程度和分析成本高,为药物残留分析带来一定难度。随着科技的发展,更多的新技术和方法也将应用于生产实践,如生物传感器方法和荧光免疫法,纳米科技、远红外和中红外也将应用于药物残留的检测中。但所有的这些方法都需要有精密的大型仪器,只能适合于中心实验室或作为确证。因此,在生产中灵敏、准确、简便、快速的ELISA检测方法倍受青睐。1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWee
3、rman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对各种微量有机物含量进行测定。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA）1.定义用酶标记抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。2.分类间接法（Indirec
4、tELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体3.原理（以双抗体夹心法为例）：显色抗体待测抗原酶标抗体EE1ELISA测定原理抗原抗体的特异免疫反应固载体吸附抗体(抗原)加待测抗原(抗体)与相应的酶标记抗体(抗原)生成抗体(抗原)待测抗原(抗体)酶标记抗体
5、(抗原)的复合物与酶的底物发生反应有色产物待测抗原(抗体)的定量与有色产物量成正比可借助吸光度值计算抗原(抗体)的量在上述反应中,酶促反应只进行一次,而抗原-抗体的免疫反应可进行一次或多次。仪器与材料37°C恒温箱、酶标板、酶联免疫试剂盒8、100µl加样器、塑料吸头；酶标抗原、待测抗原、特异抗体、稀释液、阳性对照液、底物。直接方法合成人工抗原农药分子半抗原如果有反应功能团,则可根据具体情况用适当的双功能交联试剂与交联方法使半抗原与载体偶联。对于羧基半抗原,可利用羧基通过混合酸酐法、活泼酯法或碳二
6、亚胺法等方法;对于氨基半抗原,则多采用重氮化法或戊二醛法;对于羟基半抗原则可直接与丁二酸酐衍生后再与蛋白质交联;对于巯基半抗原则可通过同源或异源双功能试剂交联;而酮基半抗原则常用氨基氧乙酸化。如徐勤惠等用碳二亚胺法合成了苯甲托品的免疫抗原,Maria等用混合酸酐法合成的免疫抗原,Antonio等利用活泼性酯法合成了三氮苯类除草剂的免疫抗原。脂肪胺类农药分子可在水溶性碳二亚胺的作用下与载体蛋白分子上的羧基结合成免疫抗原。衍生方法合成人工抗原如果农药分子中不含有反应功能团,则需先通过衍生过程在农药分子
7、内产生活性功能团再用双功能交联试剂使之与蛋白质交联。抗体制备目前,制备的抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和重组单链抗体。多克隆抗体偶尔会不识别农药分子,从而影响了标准曲线的准确性。单克隆抗体不仅特异性高,而且产生抗体的单克隆细胞可在体外传代繁殖,不受动物免疫时间限制。近些年来,随着人们对免疫球蛋白结构的认识和DNA重组技术的发展,抗体进入了第一个发展阶段—抗体库。将多种抗原一起免疫小鼠,免疫后无菌条件下取出小鼠脾,提取脾细胞总RNA。以RNA逆转录合成的cDNA为模板,PCR扩增抗体,将抗体中的轻重
8、链连接成单链抗体ScFv(Singlechainvariablefragment)。这些重组抗体比常规单、多克隆抗体的生产速度快,可通过诱变改变抗体特性,使抗体的特异性更强,而且最明显的优势是利用这项技术生产的噬菌体抗体库可同时检测多个农药残留,可制备成试剂盒用于农药残留检测。ELISA检测（竞争法测抗原）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体；取3孔酶标板分别标为空白、阳性、待测于空白、待测孔各滴入2滴标本稀释液；加10µl待测样品(含相应抗原)于待测孔，加阳性对照液1滴于阳性
