碱性磷酸酶的提取与纯化-the separation and purification of akp

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1、碱性磷酸酶的提取与纯化Exp.4ExtractionandPurificationofAlkalinePhosphatase(AKP)（目的要求）掌握用有机溶剂分离、纯化酶的原理和方法PurposeMastertheprincipleandmethodofpreparationandpurificationofenzymebyorganicsolvent有机溶剂（乙醇、丙酮、正丁醇等）通过降低酶的S而使酶沉淀析出降低介质的介电常数及对酶蛋白的脱水作用（原理）Principle33%dissolve50%pell

2、et30%dissolve60%pelleticeacetone（冷丙酮）iceethylalcohol（冷乙醇）所用试剂的作用：试剂作用NaAc(低)低渗破膜Mg(Ac)2保护和稳定AKP的作用正丁醇使部分杂蛋白变性丙酮33%AKP溶解50%AKP沉淀乙醇30%AKP溶解60%AKP沉淀注意事项：防止酶失活！①低温②慢慢滴加有机溶剂，并边加边充分搅拌④短时离心⑤沉淀上清液（弃、留）③各步加入有机溶剂量的计算要准确！（操作）一次过滤,五次离心:取10ml肝匀浆于三角烧瓶内加入2.5ml正丁醇，！充分搅拌3~5

3、min室温置10min，滤纸过滤滤纸不要用水打湿！！注意滤液（约4ml）观察并记录现象加等体积冷丙酮，立即搅拌混匀！3500rpm，5min上清（弃去）沉淀慢慢滴加，边加边搅Methods(一)（操作）沉淀加4ml0.5MMg(Ac)2溶液,搅拌,记录体积V1,留取0.2ml测活性B液,记录V10.2mlB液B1液加1.8mlTris悬液(V1´)加96%乙醇至30%,立即搅拌混匀！3500rpm,5minV=0.45(V1-0.2)沉淀（弃去）上清(V2)记录V2加96%乙醇至60%,立即搅拌混匀！350

4、0rpm,5minV=0.83V2上清（弃去）沉淀Methods(二)沉淀加3ml0.5MMg(Ac)2溶液,搅拌,记录体积V3,加丙酮至33%,3500rpm,5min记录V3V=0.5V3上清(V4)沉淀（弃去）加丙酮至50%,立即搅拌混匀！3500rpm,5min记录V4上清（弃去）沉淀加2mlTris缓冲液,搅拌C液V=V413观察并记录现象留取C液Methods（操作）(三)(结果)（上交B1和C液保存）Results记录(V1-V4)的体积及各有机溶剂所加的量(以表格形式)SaveB1and

5、Csolution！AKP溶液mlml有机溶剂V1V2V3V4VCV1，V2，V3，V4，记录体积[问题与讨论]有机溶剂提取与纯化酶的注意点及操作中的注意事项和自己的心得体会。TSGZ0004-2007(1)基本格式统一封面、目录、鉴定评审结论、明细表(2)有关填写要求见附件G4343谢谢大家