恒温扩增技术的原理与用途探究

《恒温扩增技术的原理与用途探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、精品论文，值得推荐恒温扩增技术的原理与用途探究即通过对靶序列的特异性扩增，使其产生大量拷贝，以达到检测水平。主要包括以下技术。环介导等温扩增技术，又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术，是由Notomi等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。LAMP的核心是具有链置换活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段（即5’端的F1、F2和F3区和3’端的B3c、B2c和B1c区，其中F2区和B2区为目的扩增片段）的4条特殊引物的设计，分别为上游内部引物（FIP，由F1c区和F2区组成）、下游内部引物（BIP，由B

2、1c区和B2区组成）、上游外部引物（F3，由F3区组成）及下游外部引物（B3，由B3组成）。整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。⑴起始阶段：FIP的F2序列首先和模板F2c结合，引导合成互补链；随后，F3与模板F3c结合，在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有FIP的完整互补链。此单链5’端F1c和F1自我碱基配对形成环状结构。以此链为模版，引物BIP和B3以相同的方式引导另一端链合成、链替换，从而形成哑铃状结构的单链。F1c末端可自发引导补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。此产物可作为下一阶段的起始物为LAMP基因的扩增循环提供模板。⑵优秀论文精品

3、论文，值得推荐循环扩增阶段：引物FIP与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,；释出链游离3c端自身成环,引发链延伸取代并释放FIP引导合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。引物BIP和FIP与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链DNA片段。LAMP灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，结果易于判定，这些优点使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。如：Suzuki、Iwata、Ihira等分别建立了巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EB

4、V）、人类疱疹病毒6型（HSV6）的LAMP检测方法[8-10]；Iwanoto、Hara-Kudo、Seki等分别针对肺结核分支杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌建立了LAMP检测体系，并对其灵敏度和特异性进行了评价[11-13]；而Lin、Han等分别以弓形虫病、四种疟原虫疾病为研究对象，比较了LAMP与real-timePCR、nestedPCR的检测效能，证明LAMP技术可以作为流行区现场快速而简便的疾病筛选工具[14,15]。但因建立时间较短，LAMP仍存在一些不足，其中最大的缺点就是容易出现假阳性。由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下扩增，引物之间有可能互补而扩增出现

5、非特异性条带。此外，产物鉴定只针对有或无，缺乏一定的特异性。优秀论文精品论文，值得推荐1989年首先报道的以转录为基础的和核酸扩增技术[16]。该技术从互补的靶核酸（一般为RNA）合成DNA分子开始，以新合成的cDNA为模版进行转录。反应体系主要涉及三种酶活性（T7RNA聚合酶、核糖核酸酶和逆转录酶）和两条特异引物。整个反应过程可分为非循环相和循环相。在非循环相中，以单链RNA为模板，先后在逆转录酶、核糖核酸酶和DNA聚合酶的催化作用下，生成带有T7RNA启动子的双链DNA（cDNA）；此双链DNA在T7RNA聚合酶的催化下合成大量互补于靶序列的反义RNA，由此进入循环相。循环相中，以

6、反义RNA为模板，经重复循环的进行cDNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶催化转录，使目的RNA不断得以扩增。TAS主要包括两种反应体系，即依赖核酸序列的扩增（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）和转录介导的扩增（transcriptionmediatedamplification,TMA）。前者又称为自主序列复制系统（self-sustainedsequencereplication,3SR），于1990年由Guatelli等首先报道[17]；1991年，Compton对此进行了详细描述[18]。该反应体系所涉及的三种酶为：AM

7、VRT（鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶）、RNaseH和T7RNA聚合酶。反映在42℃条件下，1.5h内即可将RNA模版扩增至109~1012倍。相对于NASBA的三酶体系，TMA使用的是二酶体系，即MMRT（money鼠白血病病毒逆转录酶）和R7RNA聚合酶。MMRT兼具有逆转录酶和RNaseH的活性，因此可省略RNaseH，从而降低反映成本，且使体系更稳定。近年来，TMA与实时荧光检测技术相结合，出现了实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）