DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍.doc

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1、双脱氧链终止法又称为Sanger法原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP，其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因为双脱氧核苷没有3’-OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片

2、段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。20世纪80年代初Jorgenson和Lukacs提出了毛细管电泳技术(capillaryelectrophoresis)。1992年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳(capillaryarrayelectrophoresis)新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛

3、细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出350bp，DNA序列,分析效率可达6000bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长3.5cM，在9min内可读取150个碱基，准确率约97%。目前,应用最广泛的应用生物系统公司(ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管,4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记,在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发,发出不同颜色的荧光,被CCD检测系统识别,并直接翻译成DNA序

4、列。杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法,该方法不同于化学降解法和Sanger法,而是利用DNA杂交原理,将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上,把待测的DNA样品片段变性后与其杂交,根据杂交情况排列出样品的序列序检测速度快,采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大,且不能重复测定焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。既可进行DNA序列分

5、析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等。1焦磷酸测序技术的原理及步骤焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNApolymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(1ueiferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS）和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成

6、ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与反应中掺人的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。在实验过程中用a-硫化的三磷酸腺苷(dATPotS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被虫荧光素识别。由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein，SSBP)和纯化SpisomerdATPaS的使用dA

7、TPotS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达100bp，拓展了该技术在遗罗氏454的GSFLX测序技术利用了焦磷酸测序原理，主要包括以下步骤：1）文库准备将基因组DNA打碎成300-800bp长的片段(若是snRNA或PCR产物可以直接进入下一步)，在单链DNA的3’端和5’端分别连上不同的接头。2）连接带接头的单链DNA被固定在DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个单链DNA片段。随后扩增试剂将磁珠乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了许多只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。3）扩增每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩

8、增(乳液PCR)，从而排除了其它序列的