ELISA IL-6(人白介素) 操作流程.doc

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1、人白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书产品编号：1910231本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中IL-6含量。实验原理用纯化的IL-6抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的IL-6抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1、酶标板：一块

2、（96孔）2、标准品（冻干品）：2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10,000pg/ml，将其稀释为500pg/ml后，再做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml，15.6pg/ml，7.8pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。如配制500pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）500pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppen

3、dorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3、样品稀释液：1×25ml。4、人白介素6:1×25ml。5、HRP,100X：1×150/瓶（1:100）。临用前以HRP1:100稀释（如：10HRP/990HRP稀释液），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。6、HRP稀释剂：1×12ml。7、浓洗涤液：1×50ml/瓶。使用时每瓶用蒸馏水稀释10倍。8、底物溶液：1×12ml/瓶，9、终止液：1×12ml/瓶（2mol/LH2SO4）。10、覆膜：4张11、使用说明书：1份自备物品1、酶标仪（建议

4、仪器使用前提前预热）2、微量加液器及吸头，EP管3、蒸馏水或去离子水，滤纸标本的采集及保存1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于1000g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。3、细胞培养物上清或其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-

5、80不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在室温溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100，余孔分别加标准品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，室温温育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的

6、标准品溶液。2、洗涤：弃掉板孔中的液体，加满洗涤液，静止放十秒，洗四次，最后在毛巾或吸水纸上拍干板子：3、每孔加HRP（临用前配制）100，加上覆膜，室温温育1小时。4、洗涤：同第二步。5、每孔加底物溶液100，酶标板加上覆膜室温避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。6、每孔加终止溶液100，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同，立即渎数。7、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）。注：1、试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照

7、说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。2、加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。3、温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。4、洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同