资源描述：
《流式细胞术地原理与应用（可编辑）.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、流式细胞术的原理与应用（可编辑）流式细胞术的原理与应用流式细胞术的原理与应用FACS:fluorescence-activatedcellsorting大型仪器中心赵彤1以FACSAria为例讲解流式细胞术的原理样本制备和结果分析流式细胞术的应用2流式细胞术的原理3流式细胞术的原理利用激光激发高速匀速运动的带有各种荧光标记的微粒,并检测微粒由此产生的散射光信号和荧光信号来反应微粒的各个参数,并将特定性状的微粒分选出来,再进行分析或培养的技术。4流式细胞术的特点?研究对象:细胞的群体信息(比例值、平均荧光强度)分析速度快:10万个细胞/秒分选纯度高
2、:99%以上可同时检测细胞的多种信息:细胞膜(浆、核)5BDFACSAria6光路系统激光器荧光收集系统7光路系统:激光光源已有激光器:488nm(蓝),633nm(红)、405nm(紫)?准备增加的激光器:375nm(紫外),561nm(橘红),等。8荧光信号收集系统407nm633nm488nm9荧光信号收集系统滤光片置于荧光探测器前,限定其接收不同的荧光范围LongpassLPShortpassSPBandpassBP460500540460500540460500540BP500/50LP500SP50010光信号变成电信号光电倍增管PM
3、T:连接光路系统和计算机分析处理系统。把光学信号转换成电子信号通过一定比例进行信号放大11FACSAria各通道的配置检测器排列可用染料LP镜片BP滤光片(激光)12BDFACSAria13样品进入鞘液液滴振荡器进入激光照射点喷嘴液流驱动系统:鞘液(PBS)包绕着单行排列的细胞依次高层流速通过流动室,而激光聚焦于流动室中心的样本流上,随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。鞘液鞘液样本14流式细胞术分选的原理喷嘴处的高频振荡器,使液流形成上段连续、下段独立的液滴,系统判断断点处的液滴是否是目标细胞,应分选到哪一路,给液滴带上相应的电荷,液滴经过电压场后
4、,发生偏转,落入到相应的收集管中。151.流动室2.电偏转板3.细胞收集器16分选的收集系统多样二路或四路分选装置:5ml管、15mL管ACDU装置:微孔板:6、8、24、96、384孔、载玻片17微孔板任意位置上分选任意数量的细胞,每孔可分选1~10万个细胞,做到精确的“点对点”分选绿色荧光微球sort后,在confocal下观察(李春立老师观察)18以BDFACSAria为例液流车:鞘液桶、废液桶、水桶、次氯酸钠桶19样本制备和结果分析20检测的微粒样本微粒:只要是一定大小的单细胞悬液均可分析动物细胞、微生物(大肠杆菌、酵母菌)、植物细胞(核
5、)、吸附蛋白beads样本要求:67?10(大细胞、肿瘤细胞)~1×10(菌)个/ml,约0.5~1ml300目筛网过滤21膜表面抗原染色(荧光素标记抗体+样本)溶血细胞膜表面标记(溶血素,去红细胞)标洗涤记抗固定与细胞膜打孔体的细胞内抗原染色步(荧光素标记抗体)细胞内或核内抗原标记骤洗涤上机22标记荧光素偶联抗体的方法间接标记法直接标记法间接标记-生物素染色法1、未标记的一抗荧光素偶联的抗体1、生物素偶联一抗+抗原+抗原+抗原2、荧光素偶联的二抗2、荧光素偶联链霉亲和素+生物素特异性强,操作步骤少多通道分析时,节约抗体种类2323488nm52
6、0nm常用荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)FITCAlexaFluro488L1蓝色激光绿色PIPE488nm黄色PE-TexasRedPE-Cy5PerCP红色PerCP-Cy5.5远红PE-Cy7红外L2APCAlexaFluro647红色激光红色APC-Cy7633nm红外L3AlexaFluro405PacificBlue紫色激光蓝色AmCyanBDHorizonV500405nm绿色24荧光素的选择选择正确的荧光素:多荧光染料同时使用时要选择光谱重叠少不同荧光通道)的染料FITC、GFP、CFSE荧光素的荧光通道PMT相同,不能同时标
7、记一个样品荧光素强度:PE>FITC>PerCP?PE最强,适用于弱表达抗原FITC最便宜,适用于强表达抗原,适用范围广25信号检测散射光信号(FSC、SSC):FALSSensor物理参数FluorescenceFluorescencedetectorPMT3,PMT4etc.荧光信号:非特异荧光+特异荧光26Freq散射光信号前向角散射光信号(FSC,ForwardScatter):与激光方向同轴侧向角散射光信号(SSC,SideScatter):与激光束垂直27前向散射光信号FSC前向散射光信号(FSC):与细胞相对大小和体积相关28侧向散
8、射光信号(SSC侧向角散射光(SSC):代表细胞内部的精细结构变化,对胞膜、胞质、核膜变化更敏感29外周血细胞散射光双参数点图30根据散
