半抗原与蛋白质偶联技术.ppt

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1、半抗原与蛋白质偶联技术目录抗原与半抗原偶联蛋白人工抗原合成的方法影响人工抗原质量的因素人工抗原的质量评定抗原与半抗原抗原抗原——能与淋巴细胞抗原受体（TCR/BCR）特异性结合，刺激机体产生特异性免疫应答，并与相应免疫应答产物（指抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合反应的物质。抗原的分类天然抗原如：细菌、病毒、真菌、寄生虫等。人工抗原如：人工结合抗原、人工合成抗原、基因工程抗原常见的天然抗原-细菌链球菌痢疾杆菌霍乱弧菌伤寒杆菌常见的天然抗原-病毒狂犬病病毒腺病毒口蹄疫病毒流感病毒常见的其他天然抗原真菌白色念珠菌(

2、1,000Xoil)疟原虫常见的其他天然抗原异种动物血清异嗜性抗原血型抗原主要组织相容性抗原肿瘤抗原超抗原人工抗原人工结合抗原——将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联，或将无免疫原性的有机分子与蛋白质载体结合，形成载体-半抗原结合物，均属人工结合抗原。人工抗原人工合成抗原——用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。（应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系。）人工抗原基因工程抗原——通过基因重组、再表达制备的抗原物质。如：目的基因（编码抗原）+载体（质粒等）重组DNA细胞（

3、真核或原核）表达纯化基因工程疫苗抗原的性质1.免疫原性：抗原刺激机体产生特异性免疫应答，诱生相应抗体和效应淋巴细胞的能力。2.抗原性:抗原可在体内、外与相应的抗体/效应淋巴细胞发生特异性结合，产生免疫应答的特性。抗原（按照免疫原性及免疫反应性）分类1、完全抗原:既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。2、半抗原:又称不完全抗原，单独存在时只具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。完全抗原半抗原与载体结合后可使其具有免疫原性。半抗原+载体完全抗原半抗原+载体抗体BT完全抗原BBBT常见的偶联蛋白常见

4、的偶联蛋白常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。常见的偶联蛋白牛血清白蛋白（BSA）包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，等电点为4.7。BSA结构常见的偶联蛋白卵清蛋ovalbvmin是一种糖蛋白。含有微量的磷。是卵清中蛋白质的主要成分，约占65％。鸡的卵清蛋白分子量约45kDa。a.牛血清白蛋白b.磷酸酪氨酸血清白蛋白c.卵清蛋白d.磷酸酪氨酸卵清蛋白常见的偶联蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH

5、)由于KLH质量大，复杂性高，与其他载体蛋白相比KLH会引起更强的免疫应答。来源于软体动物，它在系统发生上远离哺乳动物物种，在测定过程中产生会与典型靶点样品发生交叉反应的抗体的可能性较小。常见的偶联蛋白人血清白蛋白（简称HSA），是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60%。常见的偶联蛋白ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能的微生物类食品防腐剂。它是由25～30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保

6、鲜。偶联蛋白的性质载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；其次，载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子；载体还应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能；而且载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。人工抗原合成方法人工抗原合成方法小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。半抗原上的活性

7、基团人工抗原合成方法1、分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联A、混合酸酐法。B、碳化二亚胺法。C、N-羟琥珀酰亚胺酯法混合酸酐法交联原理混合酸酐法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理人工抗原合成方法2、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及pH6.0～8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的

8、半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。戊二醛法合成人工抗原的原理盐酸克伦特罗重氮化反应原理人工抗原合成方法3、含羟基半抗原的偶联1）琥珀酸酐法；2）羰基二咪唑法。人工抗原合成方法4、含巯基半抗原的偶联1)马来酰亚胺法。2)将载体蛋白与半抗原在