关于半抗原偶联载体的方案

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1、关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白

2、质连接技术。半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体.2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29](1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓

3、慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。4．(3)G6PDH—Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50u

4、l，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8)5．表2—8G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于

5、化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。因此，EDC交联法已被广泛应用，并为大家所熟悉。然而，在实践过程中，也遇到不少问题，给相关研究带来不少困难，以下就有关问题略加讨论。5.使用EDC试剂进行化学交联虽然非常方便，但它除具有同型双功能交联剂的缺点外，在合成人工抗原时，还会出现异常情况。6.如前所述，EDC是一类非常活泼的化学交联剂，据文献报道，它可以交联含有多种类型化学功能基团的化合物，包括羧酸、胺、磷酸、醇类、含巯基化合物等。交联过程至少可分为两步：如图2—l中的反应①和反应②，假定含氨基的半抗原与载体蛋白的交联是通过酰胺键连接，如反应②；

6、然而，EDC也可以通过分子重排与蛋白的羧基结合，成一种稳定的N—取代脲，这一反应过程如图2—l中的反应①和③，在此反应中，载体蛋白如是白蛋白，取代脲就结合到该蛋白的羧基上。图2—1碳二亚胺法制备人工抗原交联反应的可能机制有人认为，在用EDC合成人工抗原时，可能形成两种产物，一种是半抗原—蛋白复合物(即本合成的目的产物——人工抗原)，另一种则是取代脲—蛋白复合物(图2—1)。然而，这两种产物往往是被当作均一的人工抗原作为免疫原给动物免疫的，但是，实际上加到载体蛋白分子上的外源性抗原决定族就有两种，一种是半抗原的，一种是取代脲的，因而，也就可能产生两种抗体

7、。后一种抗体往往对半抗原的检测专一性和灵敏度有明显的干扰，使问题复杂。用第一种碳二亚胺合成半抗原一蛋白结合物，即用于免疫动物的人工抗原(免疫原)；而用第二种碳二亚胺合成的结合物作为抗体的检测抗原，当然，两者也可调换使用。可以选用的两种水溶性碳二亚胺是EDC和CMC(图2-2),其化学名称分别为1-ethyl—3一(3一dimethyl—aminopropyl)carbodiimidehydrochloride〔1一乙基一3一(3一二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐，EDC或Ethyl—CDl]和1—cyclohexyl—3—(2—morph0linyl—(4

8、)—ethyl)carodiimidemetho—p—t01uenesulfonate〔1—环