流式细胞仪生产牛性控冷冻精液技术要点

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1、流式细胞仪生产牛性控冷冻精液技术要点薛建华，吕小青，李艳华，杜欣悦，朱玉林，孙凤俊（北京奶牛中心延庆基地102100）目前，分离动物X、Y精子最有效的方法是应用改进后的流式细胞仪（SX-MoFlo）。它根据X、Y精子DNA含量的差异，借助特异染色剂染色，经过染色的精子通过流式细胞仪时，由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成了包含单个X精子或者Y精子的微小液滴逐个与激光交截，精子上的荧光染料Hoechst33342被紫外激光（～350nm）激发会产生蓝色激发光（～460nm）。由于X精子上所含有DNA比Y精子多，结合的荧光染料就多，所激发出的荧光强度比Y精子强。蓝色激发光被正

2、、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号，同时将接受到的信号传入主控机，根据其荧光强度的差别分辨出X精子和Y精子。同时，给被判别的包含单个X精子或者Y精子的微小液滴加载正电荷或者负电荷，携带正电荷或者负电荷精子的液滴在电场力的引导下，分别落入不同的收集容器中，使X精子和Y精子得以分离。流式细胞仪在精子分离研究中的应用始于FriedrichOtto等对人精子的研究，Johnson等[1]采用该法成功分离了多种动物的精子。分离后X和Y精子的纯度在牛、羊和鹿高达90%以上[2],分离后的精子可用于不同的输精方式，如手术输精(子宫内、输卵管内)、人工授精(子宫深部、子宫颈部)以及体外受精(I

3、VF)和胞质内精子注射(ICSI)等。流式细胞仪精子分离法所获得的首例成活后代是经子宫内手术授精出生的兔子。Johnson等研究证实,用此法分离的X精子对母兔进行子宫内手术授精,获得94%的雌性仔兔,用Y精子授精获得81%雄性仔兔[3]。对牛的低剂量人工授精获得的预定性别后代准确率接近90%[4]。牛、猪和兔的精子分离后代可以正常繁殖下一代[5]。研究初期由于技术条件的限制,只有30%左右的精子通过流式细胞仪时能够准确地根据其荧光量大小而得到分离[7]。随着流式细胞仪的改进,精子分离效率有所提高,目前X或Y精子的平均分离速度可达5000～6000个/秒，最新式的分离仪每秒可以分离

4、8000个精子，X精子的分离纯度可达到90%以上，Y精子纯度可达到85%以上。我国广西大学、内蒙古赛科星生物技术公司、大连金弘基种畜有限公司、大庆田丰生物工程公司等已先后引进了流式细胞仪。目前,分离的冻精在市场上出售已有8年的时间。取得了较好效果，经济效益显著。应用流式细胞仪生产性控冷冻精液的技术要点总结归纳如下。1鲜精处理种公牛选择以体型外貌、精液质量以及后裔成绩为主要条件。将采精员采集的精液通过专用传递窗口送到处理室，首先肉眼观察精液的颜色，合格鲜精的色泽要求为乳白色或稍带淡黄色,其它颜色视为不合格。然后检查活力及密度。鲜精在38℃条件下，在200～400倍显微镜下观察活力，

5、每个样片观察5个视野，并观察不同液层内的精子运动状态；活力≥75%、畸形率≤18%，没有粘连的鲜精可以用于进行分离；使用光电比色计或分光光度计测定原精密度，密度8～15亿/ml时分离效果较好。2荧光染料（Hoechst33342）染色经过品质评定后，根据原精液量的多少，添加混合抗生素，摇匀后放入19℃恒温保存备用。使用前将4%卵黄液（含食物色素即FD&CRedNo.40）、稀释液(TALP)即染色液，放置34℃水浴锅内预热。染色步骤及方法：根据原精密度大小计算染料的梯度、精液量及精子稀释液(TALP)用量（简便公式：精液用量（微升）=2÷密度（亿）×1000），TALP用量=10

6、00-精液用量（微升）-荧光染料用量的一半）。一般使用34～36微升的HO33342荧光染料进行梯度染色，染料的浓度为5mg/ml。步骤：首先向上样管中加入荧光染料，然后加入预热后的染色液，用涡流震荡器振荡使之混合均匀，再加入原精，轻轻摇匀后放入水浴锅内暗室孵育45分钟。染色结束后再加入含4%的卵黄液2ml着色以覆盖死亡精子，上下摇匀后用50微米过滤器过滤到另一个上样管内，送到分离实验室分离。上样管液体体积为4ml，精子数为1亿/ml，以原精样品中的死精率在20%以下为限，每次采集的原精从采集时间算起可使用12～16h。3精子分离操作调试流式细胞仪激光系统、流体系统及电学控制系统

7、、调整液流、做液滴的时间延迟、分选等参数，调试到所需要的范围内。3.1激光系统控制激光管使用时功率控制在350mw为宜，以提高SX-MoFlo牛精子分离速度和分离准确度。3.2流体系统操作调试鞘液罐使其正压表显示为40Psi，废液罐负压表显示在-10～5Psi之间。如果出现压力不稳定，可能是鞘液罐和废液罐盖子没有拧紧；连接管路漏气；上样口密封不严等原因造成的。3.3电学控制系统操作开启电学工作台，设置分离单元参数使之达到：频率60,000～70,000HZ之间、振幅30V左右、相