真菌的分离培养及形态观察和无菌操作.doc

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1、真菌的分离培养及形态观察%1.真菌的分离培养方法（一）平板划线分离法1.取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45°C,注入无菌平J11L+,每川!■15〜20ml,制成平板待用。2.取要分离的材料（如出土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。3.将接种坏经火焰灭菌并冷却后,蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线（同细菌的划线法）。4•划线完毕，置温箱屮培养2〜5d,待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检杳，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落屮钓少许菌制成悬液，再作划线

2、分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌辍子夹取一-段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。（二）稀释分离法1.取盛有无菌水的试管5支（每管9ml）,分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田土等）lg，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。2.用lml火菌吸管，按无菌操作法，从1号管屮吸取1ml悬浮液注入2号管屮，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，肓至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。3.用2支无菌吸管分别由4号、5号试管屮各取lml悬液，并分别注入2个灭菌培养川

3、［屮,再加入融化后冷至45°C的琼脂培养基约15讪，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，2〜5d后，从屮挑选单个菌落，并移植于斜面上。%1.真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1.酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状,表面光滑、湿润、黏稠,有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有報齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色或红色等。2.霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2〜5d,nJ'见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直

4、径1〜2mm或更小）。很多霉菌的饱子能产生色索，致使菌落表面、背面茯至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。（二）真菌在液体培养基中的生长表现1.酵母菌注意观察其混浊度、沉淀物及表瓯生长性状等。2.霉菌霉菌在液体培养基屮生长，一般都在表面形成菌层，且不同的霉菌有不同的形态和颜色。%1.真菌的形态观察（一）真菌水浸片的制备及观察常川美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无色，故可区别死细胞、活细胞。1.酵母菌水浸片的制备将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片屮央，如不染色则加蒸锚水一滴，用接触环以无

5、菌操作収培养48h左右的酵母菌体少许，在液滴小轻轻涂抹均匀（液体培养物可直接取一接种环培养液于玻片上）并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢慢放下盖片。然后置于显微镜载物台上进行观察,注意酵母菌的形态、大小和芽体,同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。1.霉菌水浸片的制备在干净载玻片上加蒸憎水或美兰染色液一滴。取培养2~5d的根霉或毛霉、培养3〜5d的曲霉、讶霉或木霉、培养2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要选择有无性他了的菌体，用解剖针挑取少量菌丝体放在载玻片的液滴屮，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剖£1•将菌丝体

6、分散成白然状态，然后加盖玻片，注意不要让其产生气泡，盖后不再移动玻片，以免弄乱菌丝。制好片后，就可以在显微镜下观察。观察时注意它们的菌丝有无隔膜、砲子囊柄与分生砲了柄的形状、分生砲了小梗的着生方式、他了囊的形态、足细胞与假根的有无、砲了囊抱了和分生雀了的形状和颜色、节抱了的形状和特点等。并且要区别根霉与毛霉、青霉、曲霉、木霉之间的异同点以及白地霉的特点。（二）霉菌封闭标木的制备霉菌的封闭标木，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使标木不宜干燥，而石炭酸又有防腐作用。在封片液中，还可加入棉蓝或其它酸性染料，以便于观察菌体。在洁净载玻片上滴一滴

7、乳酸石炭酸棉蓝染色液，川解剖针从霉菌菌落的边缘处取少许带冇砲了的菌丝于染液屮，再细心地把菌丝挑成自然状态,然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。在温暧干燥室内放数口，让水分蒸发一部分，使盖玻片与载玻片紧贴，即可封片。封片时,先用清洁的纱布或脱脂棉将盖玻片四周擦净，并在盖玻片周用涂一圈加拿大树胶或合成树胶，风干后即成封闭标本。（三）真菌的载片培养真菌的载片培养法不仅可克服水浸片制片的困难，还可使对菌丝分枝和他了着生状态的观察获得更满意的效果。取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个頁径9cm的平1111底部（图5-1）,」放—U形玻棒，其上再平

8、放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平血盖进行灭菌。挑取真菌砲了接入盛有灭菌水的试管屮，摇振试管制成砲了悬液备丿IJ。用灭菌滴管吸取灭菌示融化的真菌同体培养基少许，滴于上述灭菌平