实验三、微生物的接种、分离和培养以及无菌操作

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1、实验三、微生物的接种、分离和培养以及无菌操作一、实验目的1、掌握几种常见的菌种分离纯化、接种方法。2、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。二、实验原理　　微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞(或孢子)尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。三、实验材料

2、　　1、恒温培养箱。　　2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。　　3、YPD培养基、LB培养基。　　4、金黄色葡萄球菌、酵母菌。四、实验方法　(一)接种的操作　　1、斜面接种(接酵母菌)　　(1)操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。　　(2)将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。　　(3)先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。　　(4)左手拿接种环(如握钢笔一样)，以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。　　(

3、5)用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出(图7-1.2)，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧过烫)。　　(6)将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。　　(7)迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。　　(8)接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。(9)将接

4、种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。图1.斜面接种示意图　　2、液体接种　　(1)由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。　　(2)由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管或滴管。接种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀即可。　　3、平板接种　　

5、将菌在平板上划线和涂布。　　(1)划线接种见分离划线法。　　(2)涂布接种用无菌吸管吸取菌液注入平板后，用灭菌的玻棒在平板表面作均匀涂布。　　4、穿刺接种　　把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。　　(1)操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。(2)将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。穿刺接种琼脂固体穿刺生长形状(二)分离的操作方法　平板划线分离法　　平板划线分离法是接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的

6、一种方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。　　(1)倒平板溶化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，水平静置待凝。　　(2)在酒精灯光焰上灼烧接种环，待冷，取一接种环金黄葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液。　　(3)左手握琼脂平板稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作之形回划线，划线时例接种环与平板表面成30-40°角度轻轻接触，以腕力在表面作轻快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进增基内。　　(4)灼烧接种杯，以杀灭接种环上尚残余的菌液，待冷却后，再将接

7、种环伸入皿内，在第一区域划过线的地方稍接触一下后，转动90°，在第二区域继续划线。　　(5)划毕后再灼烧接种杯，冷却后用同样方法在其他区域划线(图7-8、9)。　　(6)全部划线完毕后，在平皿底用特种蜡笔注明菌种、日期、组别、姓名。将整个培养皿倒置放入恒温箱培养。(7)37℃经过24-48小时培养后取出观察。注意菌落的开关、大小、颜色、边缘、表面结构、透明度等性状。图3.平板划线分离示意图