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《丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析及应用评价.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第24卷第11期核技术Vol.24,No.112001年11月NUCLEARTECHNIQUESNovember2001丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析及应用评价121222肖华龙黄飙朱利国潭成蔡刚明金坚1(江苏省原子医学研究所附属江原医院无锡214063)2(核医学国家重点实验室无锡214063)摘要为建立抗-HCV的时间分辨免疫荧光分析法(IFMA),以HCV抗原包被微孔板,样品中的3+抗-HCV、Eu标记羊抗人IgG形成夹心,以β-二酮体为增强液,数据采用Log-Logit函数和四参数Logistc函数
2、数据处理程序处理。结果表明,方法的批内和批间CV分别为3.64%和4.39%,平均回收率105.58%,可测范围为1.01—17.34NCU/mL,灵敏度为0.03NCU/mL。本法与HB2sAg有0.23%的交叉,与HBeAg有0.04%的交叉。278例正常对照组血清抗-HCV浓度均小于1NCU/mL。结果提示,高度灵敏、稳定的抗-HCVIFMA方法的建立为临床和科研工作提供了一种非放射性标记定量检测分析的方法。关键词抗-HCV,时间分辨免疫荧光分析中图分类号R446.61抗-HCV是HCV感染机体后出现的特异
3、性抗体,它是HCV感染和具有一定传染性的标志。由于丙型肝炎可经输血、母婴垂直传播、血制品、静脉用药、性接触、体液等多种途径传播,且与肝硬化、肝细胞癌密切相关,因而早期发现、及早治疗,对于控制HCV的传播,降低其所致丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌具有十分重要的意义。本工作利用时间分辨荧光分析技[1,2]术,建立了抗-HCV抗体时间分辨免疫荧光分析法(IFMA)。1材料与方法1.1材料与试剂HCV抗原(HCVAg)、羊抗人IgG,由上海科华公司提供。EuCl3和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)为Sigma产品。Sephade
4、xG-50和PD-10柱为Pharmacia产品。发光增强液和Eu2Cl3标准品为EG&Gwallac产品。牛血清白蛋白(BSA)为卫生部上海生物制品所产品。牛γ球蛋白(BIgG)由本实验室从牛血清中纯化制得。其余试剂均为国产分析纯。超纯水用美国Barnstead公司生产的D7033超纯水器制备。96孔可拆式微孔板条为厦门新创公司产品。HCVELISA试剂盒为上海科华公司产品。1.2主要仪器全自动时间分辨荧光检测仪AUTODELFIA1235为芬兰EG&GWallac产品,该实验分析程序软件由本实验室自编。酶标仪
5、P-450为Bio-Rad产品。1.3HCVAg固相抗原的制备HCVAg用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6的缓冲液稀释至10mg/L,在96孔微孔第一作者:肖华龙,男,1961年5月出生,1982年7月毕业于四川医学院卫生系检验专业,主任技师。收稿日期:2000-11-01,修回日期:2001-03-13892核技术第24卷板上,每孔加入200μL,4℃过夜后冲洗3次。加3g/L的BSA200μL/孔封闭过夜。洗涤后抽干冷冻保存。3+1.4Eu-羊抗人IgG单抗的制备1.4.1环化DTPA(c
6、DTPA)的合成和鉴定在250mL烧瓶中加入5gDTPA、50mL无水砒啶、5mL乙酐,于65℃N2保护状态下搅拌过夜,过滤,滤饼用无水乙醚洗涤两次即得。mp-1181-185℃(分解),IR1830cm。1.4.2标记化合物的制备分别将羊抗人IgG单抗和cDTPA溶于0.2mol/LNaHCO3和二甲基甲酰胺中备用,浓度为5g/L和20g/L。于尖底玻璃试管中依此加入200μL羊抗人IgG单抗和25μLcDTPA后立即调pH至8.5,4℃磁力搅拌反应4h。反应液经PD-10柱对生理盐水交换后,加入30μL33m
7、mol/LEuCl3,室温反应2h,进行预经含0.9%NaCl和0.1mL/L的50mmol/LTris-HClpH7.8缓冲液平衡过的SephadexG-50柱层析(1×40cm),紫外A280检测收集洗脱蛋白峰。1.5IFMA的建立反应缓冲液为含0.9%NaCl、0.1%BSA、0.2%BIgG、50μmol/LDTPA和0.1mL/LTween-80的50mmol/LTris-HCl,pH7.8。洗板液为含0.09%NaCl和0.05mL/LTween-80的50mmol/LTris-HCl,pH7.8。在
8、包被有HCVAg的微孔板上每孔分别加入25μL科华公司提供的抗-HCV参考标准、阴阳性对照血清或待测血清样品。每孔各加入200μL反应3+缓冲液,25℃振荡孵育2h,吸干孔中液体,用洗涤液洗涤4次。每孔加200μL0.5mg/LEu-羊抗人IgG单抗,25℃振荡孵育0.5h。吸干液体用洗涤液洗涤4次。每孔加发光增强液200μL,25℃振荡反应5min,检测荧光强度。以上全
