丙型肝炎病毒不同片段抗体蛋白芯片的制备及评价

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1、丙型肝炎病毒不同片段抗体蛋白芯片的制备及评价作者：何谦，楚雍烈，林联成，王香玲，刘余静【关键词】肝炎病毒PreparationandevaluationofprotEinchipfordifferentHCVantibodydetection　　【Abstract】AIM:ToprepareandevaluatetheclinicalapplicationofprotEInchipfordifferenthepatitisvirusC(HCV)antibodies.METHODS:ProteinchipfordifferentHCVan

2、tibodiesericantigenandthe4segmentsofHCVantigensontheslide.TheresultsofthismethodericantigenaccordedetoRIBA,theaccordancerateentsofHCVantigensa公司）；不同片段抗体标准品由深圳赛尔生物技术有限公司惠赠；RIBA3.0试剂，载玻片（美国Chiron公司）；抗HCV（ELISA）试剂（上海永华细胞和基因高技术分析中心）；血清标本99例，均来源于西安交通大学第一医院和第二医院门诊及住院患者.　　1.2方法

3、　　1.2.1包被和封闭将融合抗原及各片段抗原配成不同浓度，用点样仪将其点样于醛基化玻片上，37℃温浴2h后晾干.用含100mL/L小牛血清的PBS(0.01mmol/LPBS,pH7.2)37℃封闭2h，晾干放于4℃冰箱过夜后备用.　　1.2.2检测取出制备好的芯片，加1∶10倍稀释血清10μL，37℃水浴30min，PBST（0.01mmol/LPBS,pH7.2,0.5mL/LTin，PBST洗涤5次后，用ScanArray4000B扫描仪扫描.　　1.2.3结果判断不同片段中有一个阳性判为可疑，两个或以上片段阳性则判为阳性标本.

4、　　统计学处理：方法准确性判断采用Youden指数，方法一致性判断采用Kappa值.　　2结果　　2.1实验条件选择用棋盘滴定法进行抗原浓度、样品稀释倍数及CY3抗人IgG结合物浓度的确定.不同浓度的各片段抗原点样，测试标准品并与RIBA试剂比较，符合率最高者为点样浓度.结果以融合抗原100μg/L,C区抗原100μg/L,NS4抗原50μg/L,NS5抗原50μg/L为最佳.样品稀释倍数以1∶10为宜.CY3抗人IgG结合物浓度测定以1∶500为最佳浓度.　　2.2重复性和稳定性试验将上述包被好的蛋白芯片分别置于4℃冰箱和室温下贮存7

5、d和1,3,6mo后取出，用上述方法分别检测20例阳性标本和正常对照，结果与新鲜包被的蛋白芯片一致.　　2.3特异性试验取甲肝抗体阳性、乙肝表面抗体阳性、巨细胞病毒抗体阳性、类风湿因子阳性血清各20份，用本试剂检测，结果均为阴性.　　2.4不同丙肝抗原片段Cutoff值（S/n）的确定检测407例正常人血清，计算每种抗原的平均荧光强度，求得信噪比.各片段阴性对照的信噪比应小于2.5.Cutoff值等于各片段阴性对照平均值加3倍标准差，片段信噪比大于Cutoff值时该片段抗体为阳性（Tab1）.表1不同丙肝抗原片段的均值、标准差和Cuto

6、ff值（略）　　2.5考核评估蛋白芯片各片段检测与RIBA确证试剂进行比较，结果见Tab2.表2HCV蛋白芯片与RIBA各区段抗体检出比较（略）　　2.6抗HCV（ELISA）试剂和蛋白芯片法的比较抗HCV（ELISA）试剂检测样本99例，其中阳性标本69例,阴性30例.30例抗HCVELISA试剂检出的阴性样本，蛋白质芯片的融合抗原检测均为阴性，蛋白质芯片的分片段检测均为阴性；69例抗HCVELISA试剂检出的阳性样本，蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性2例；蛋白芯片分片段检测根据不同片段中有1个阳性判为可疑，2个或2个以上

7、阳性则判为阳性标本的判定标准，蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性1例，可疑标本1例.统计学分析表明，蛋白芯片的融合抗原检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8%，阳性符合率为97.1%,具有较好的一致性（Kappa值=0.953,P<0.05）.蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为96.8%，阳性符合率为97.1%，具有较好的一致性（Kappa值=0.954,P<0.05）.　　2.7RIBA试剂和蛋白芯片法的比较RIBA试剂检测样本99例，其中阳性标本66例,阴性31例，可疑标本2例.蛋白质芯片

8、的融合抗原检测检出阳性67例，阴性32例.蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性31例，可疑标本1例.统计学分析表明，蛋白芯片的融合抗原检测与RIBA法相比，阴性符合率为96.9%,阳性符合率为98.5