毛蚶外套膜和鳃组织中神经型一氧化氮合酶免疫组织化学定位研究.pdf

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1、2017年№3毛蚶外套膜和鳃组织中神经型一氧化氮合酶免疫组织化学定位研究孙敬锋，王一泽。吕爱军，YeongYikSung，董少杰，郭永军。邢克智(天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384)摘要：应用免疫组织化学方法研究神经型一氧化氮合酶在毛蚶(Scapharcakagoshimensis)外套膜和鳃组织中的分布及定位，应用蛋白免疫印迹技术对外套膜和鳃组织中的神经型一氧化氮合酶进行鉴定，并对其分子量进行测定。免疫组织化学研究结果表明，神经型一氧化氮合酶的阳性结果显示为棕褐色，主要分布于细胞质中。在外套膜组织边缘膜和边缘膜突起的上皮细胞、疏松结缔组织黏液细胞和血细

2、胞有阳性反应；在鳃组织的鳃丝黏液细胞、血细胞和上皮细胞中有阳性反应。蛋白免疫印迹研究结果表明，外套膜和鳃组织的SD孓PAGE电泳图谱中有两条阳性反应条带，分子量分剐为120kD和80kD。实验结果为深入研究一氧化氮及神经型一氧化氮合酶在毛蚶外套膜和鳃组织中的生理功能提供了组织形态学资料。关键词：毛蚶；外套膜；鳃组织；神经型一氧化氮合酶；免疫组织化学定位中图分类号：s917．4文献标志码：A文章编号：1003—6482(2017)03—115一06引言一氧化氮(nitricoxide，NO)可以参与动物机体多种重要的生理病理活动，而NO是由一氧化氮合酶(nitricoxidesyntha

3、se，NOS)催化L一精氨酸发生氧化反应生成。一氧化氮合酶包括神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)3个亚型。由于还原型辅酶Ⅱ黄递酶(NADPH—d)与NOS在化学结构和组织定位上具有极高的一致性，且也与NO生成密切相关，故人们常采用NADPH—d酶组织化学染色法来显示NOS分布及活性[1‘3]。但随着对NOS分子生物学性质认识的不断深入，发现NOS与NAD

4、PH—d酶存在许多本质的差异，如分子量、氨基酸序列和酶活性结构域等，而且，利用NADPH—d组织化学染色法无法区分NOS的3种亚型。而免疫组织化学法可以利用抗原与抗体的特异性结合，做到准确地区分NOS各亚型H_9]。nNOS是依赖钙和钙调蛋白的组成型表达酶，在脊椎动物中主要分布于神经元和神经纤维[4]。nNOS活性的精细调控对于许多生理和病理过程有着至关重要的意义，在许多疾病的发生和发展过程中都伴随着nNOs表达水平或活性的升高n⋯。贝类外套膜与水环境直接接触，容易受到病原的感染，因此，外套膜免疫能力的强弱直接关系到贝类的抗病能力。贝类鳃丝上皮组织和结缔组织中含有大量具有吞噬作用的血细

5、胞和分泌抗菌、溶菌物质的粘液细胞。双壳贝类的鳃既是滤食器官，也是呼吸器官，并通过外套腔直接与水环境接触，在机体防御中，鳃组织也起着重要的作用口1

6、。有关双壳贝类鳃和外套膜的研究，多集中在其形态结构方面，关于nNOS在双壳贝类外套膜和鳃组织中的分布及定位研究仅有少量文献涉及[6’9’12]。目前对毛蚶外套膜和鳃组织中nNOS免疫组织化学定位研究未见报道。本试验采用免疫组织化学法对毛蚶外套膜和鳃组织基金项目：国家自然科学基金项目(31272692)；天津市应用基础与前沿技术研究重点项目(15JCzDJc34000)；国家贝类产业技术体系建设专项资金项目(cARs一48)；天津市高等学校”现

7、代水产生态健康养殖”创新团队项目(TDl2—5018)资助第一作者简介：孙敬锋(1976一)，男，山东东平人，硕士生导师，教授，研究方向为渔业资源生物学／水产动物病害及免疫学．E—mail：sunjf@163．com收稿日期：2016一02一08ygOonH阿艮L鬲辽a、型yg沼山湖嘞O洋dS海．啪乱吕}m海洋湖沼通报中nN()S的分布及定位进行研究，采用蛋白免疫印迹技术对nNOS进行鉴定，并对其分子量进行测定，为全面揭示nN()s在毛蚶外套膜和鳃组织中的生理作用及作用机理提供形态学资料。1材料与方法1．1试验材料毛蚶购于天津市王顶堤红旗水产批发市场，挑选体表完整、鲜活的4龄毛蚶(壳高

8、，30～42mm；壳宽，25—37mm；壳长，37—50mm)40个用于试验。1．2试剂一抗(绵羊抗小鼠nNOS)和二抗(兔抗绵羊IgG)购于英国Abcam公司，辣根酶标记链亲合素、DAB试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；I，一多聚赖氨酸、苏木素染液购于北京鼎国生物技术有限公司；蛋白Marker购于生工生物工程上海(股份)有限公司；包埋剂(NEG50)购于Thermo公司。1．3样品采集与处理将40个毛蚶从海水中取出置于冰盘上，快速取出外