华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定.pdf

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1、分类号：Q窆鳋密级：公珏单位代码：学号：10086200829华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定ConstructionofcDNAExpressionLibraryofHolotrichiaoblitalarvaeandIdentificationofitsPeritrophicMembraneTargetProteins学位申请人：刘小民指导教师：郭巍教授学科专业：农业昆虫与害虫防治学位类别：农学博士授予单位：河北农业大学答辩日期：二O一一年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研

2、究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：；、】．-·民签字日期：少，1年多月弓日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦盔些塞堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑皇垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进

3、行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：矽『／年学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：砭^队易日导师签名．刮嚣签字日期：州f年乡月弓El电话：邮编：●J月、磊‘．摘要珊IIIlll／IIIIIIIJIIlIIf／IrlIIfY1897565华北大黑鳃金龟(Holotrichiaob厅m)为鞘翅目鳃金龟科昆虫，是国内外公认的难防治的土栖性害虫。围食膜(peritrophicmembrane，PM)是昆虫体内保护其中肠的第一道天然屏障，在昆虫中肠的消化过程及保

4、护昆虫免受微生物和寄生虫侵害等方面发挥着重要作用。昆虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定能够为深入研究害虫的生防机制，寻找生物防治新靶标，以及进一步明确围食膜与病原微生物之间相互作用的分子机理等提供前提和基础。本研究在构建华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库的基础上，对其进行免疫筛选，并对筛选得到的围食膜靶标蛋白进行了分离与鉴定，所得的主要结果如下：1．提取华北大黑鳃金龟幼虫中肠总RNA，分离得到mRNA，利用Uni．ZAPXR载体，成功构建高质量的华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库。经鉴定，该cDNA文库滴度为5．18X106pfu／mL，重组率为98．

5、8％，扩增后文库滴度为2．36×10’pfu／mL，插入cDNA片段的长度平均为1．85kb。其后，以棉铃虫(Helicoverpaarmigera)围食膜蛋白血清为抗体，对该文库进行免疫筛选。经过筛选，共得到阳性克隆254个。其中包括4个全长基因HoCBP2、HoCBP76、HoSCP、HoChf，以及1个基因片段崩班M。2．HoCBP2基因及胁CBP76基因，编码华北大黑鳃金龟幼虫围食膜几丁质结合蛋白。其中胁C戤)2基因全长2226bp，GenBank登录号为JF681185，开放阅读框长1947bp，编码649个氨基酸。HoCBP2蛋白N．端

6、具有19个氨基酸的前导信号序列，预期蛋白分子量70．2kDa，等电点3．52。Blast比对结果显示，其序列与鞘翅目昆虫赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)围食膜蛋白PMPl4(GenBank登录号GUl28106)相似性最高，为35％。结构域分析表明HoCBP2蛋白包含8个具有peritrophin．A结构特征的几丁质蛋白结合功能域(CBD，chitinbindingdomain)。HoCBP76基因全长2019bp，GenBank登录号为JF681186，开放阅读框长1725bp，编码575个氨基酸。HoCBP76蛋白N．端具有19

7、个氨基酸的前导信号序列，预期蛋白分子量62．3kDa。等电点3．51。BlastL匕对结果表明，其序列与Triboliumcastaneum围食膜蛋白PMPl4相似性最高，为34％。结构域分析表明HoCBP76蛋白包含7个CBD。成功构建原核表达载体pET21b．HoCBP2和pET21b．HoCBP76，分别表达了约120kDa及110kDa的目的蛋白。利用Bac．to．Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建了重组表达载体Bac．HoCBP2及Bac．HoCBP76，转染BTI．Tn．5B1-4细胞，实现了其在昆虫细胞中的成功表达。Westernbl

8、ot检测表明，重组后的HoCBP2和HoCBP76蛋白表达的蛋白分子量约为120kDa和110kDa。几丁质结合活性试验结