中药粉末无菌检查法验证.doc

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1、***无菌检查方法学验证为了保证本品无菌检查方法的检验质量，确保检验结果的准确性和可靠性，根据《中国药典》（2010年版）要求，我们对***的无菌检查进行了方法学验证考察。验证结果如下：1、菌种：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]白色念珠菌[CMCC（F）98001]黑曲霉[CMCC（F）98003]以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供，以上

2、菌种所用菌株传代次数均未超过5代，符合验证试验要求。2、材料和仪器2.1供试品：***，批号：20130402，滨州蓝海中医药科技研究中心提供，标示：高压灭菌。***，批号：20130402，滨州蓝海中医药科技研究中心提供，标示：辐照灭菌（2.8kGY）。2.2培养基：营养琼脂培养基（批号1103162中国药品生物制品检定所）营养肉汤培养基（批号101215中国药品生物制品检定所）玫瑰红钠琼脂培养基（批号110222中国药品生物制品检定所）改良马丁培养基（批号110211中国药品生物制品检定所）改良马丁

3、琼脂培养基（批号101028中国药品生物制品检定所）硫乙醇酸盐流体培养基（批号110214中国药品生物制品检定所）蛋白胨水培养物（批号100803中国药品生物制品检定所）62.3仪器LRH-250A生化培养箱（广东省医疗器械厂）YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业）HH-B11-600电热恒温培养箱（天津实验仪器厂）9240MBE数显鼓风不锈钢干燥箱（上海博迅有限公司）HZY-III型智能集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司）全封闭集菌培养器（杭州高得医疗器械有限公司）2.4稀释剂0.9

4、%无菌氯化钠溶液0.1%蛋白胨水溶液2、菌液制备（1）将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至10ml营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基10ml中，30℃～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-3～10-8，使菌数小于100cfu/ml，见表1。（2）接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基10ml中，30℃～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加到9ml0

5、.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-8，使菌数小于100cfu/ml，见表1。（3）将白色念珠菌的新鲜培养物分别接种至10ml改良马丁液体培养基中，23℃～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-6，使菌数小于100cfu/ml，见表1。（4）将黑曲霉的新鲜培养物接种至10ml改良马丁琼脂培养基中，23℃～28℃培养5～7天，加3ml～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，取

6、1ml菌液加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使孢子数小于100cfu/ml，见表1。表1活菌预试验——活菌计数菌名大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉代数第三代第三代第三代第三代第三代第三代第三代稀释级10-71ml10-41ml10-61ml10-71ml10-61ml10-51ml10-51ml6次数166745356598550263665359628648平均值64.5705357.560.585.5494培养

7、基灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。结果见表2表2：培养基灵敏度检查结果培养基菌种管数观察结果1d2d3d4d5d硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌1+++2+++铜绿假单胞菌1+++2+++枯草芽孢杆菌1+++2+++

8、生孢梭菌1+++2+++空白组—————改良马丁培养基白色念珠菌1+++++2+++++黑曲霉1+++++2+++++空白组—————“—”表示无菌生长。“+”表示生长良好结果判定：6空白对照管无菌生长，加试验菌的培养基管均生长良好，该培养基的灵敏度检查符合规定。5．检验方法验证5.1预实验5.1.1采用了直接接种法，取本品0.5g，分别直接加入到100ml、200ml、500ml体积的培养基进行培养，经过试验发现，由于本品为中药细粉，在培