基因克隆的四大要素(Four-Elements-for-Gene-Cloning).doc

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1、将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。22楼一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（DNAligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA聚合酶（DNApolymerase）等。因此，酶是DNA重组技术中必不可少的工具，基因工程

2、中所用的酶统称为工具酶。工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。基因重组正是利用了这些工具酶对DNA分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA分子的切割和连接。因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。首先重点介绍限制性内切酶（restrictionendonucleases＝restrictionenzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973年完成的，StanleyCohe

3、n，HerbertBoyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列甲基化),避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA的切

4、割，来限制外源性DNA侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类：第I类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000个核苷酸对处切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。第II类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP提供能量。第III类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序

5、，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边24-26个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。其中II类酶在基因重组中最有应用价值。因此以下内容均以II类限制性内切酶为主。1．限制性内切酶的命名和书写限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。现在通用的命名原则是：第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。比如限制酶HincⅡ和HindⅢ则是分别来自流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的c和d血

6、清型菌株。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表，如表2.1所示。2．限制性内切酶的特点：①识别特定的核苷酸序列：长度一般为4~6bp并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。例如：②具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。通常双链DNA被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。③由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱

7、基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。例如，限制酶BamHI和BglⅡ都能识别各自的6核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC和AGATCT，因此