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时间:2020-08-29
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1、PCR反应模板的制备 PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计,酶的质量.模板的制备,在前二者都稳定可行的情况下,PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基本技能,决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的产量. 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份,溶解细胞膜,使蛋白质变性,再用蛋白酶K来消化去除蛋白质,尤其是与DNA结合的蛋白质,再用酚:氯仿抽提,然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸
2、,供PCR实验用.但近几年来也发展了些简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化处理标本,视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定.模板核酸的提取制备方法 (一)蛋白酶K消化裂解法:适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿,粪便等. 1.试剂配制 ①蛋白酶K消化液:10mmol/LTris.cl(PH8.0) 10mmol/LEDTA 150mmol/LNaCL 0.5%SDS 100~200ug
3、/ml蛋白酶K. ②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,临用时加入消化液中. 2.提取方法: 有些标本、在用蛋白酶K消化前,还需预处理一下,如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等,其方法有离心去掉杂质,脱蜡等. 临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混匀,55℃1~3小时,或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1~2次,再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一次,上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液,加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转
4、/min离心15min.小心吸弃或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1~2次,特别小心的吸弃或倒掉上清,真空或37℃温箱或室温干燥,加TE缓冲液20ul.溶解后,取3~8ul用于PCR扩增,或放-20℃保存. 蛋白酶K消化法除上述经典处理法外,亦可在蛋白K消化处理标本,经离心处理后,吸取上清经95~97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR扩增.如杂质较多,还可经酚:氯仿抽提后,即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除彻底,Taq酶活性不受影响,具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复,技术
5、要求高. (二)直接裂解法:标本(组织细胞,分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后,加消化裂解液20~50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20),95~98℃,15~30min以裂解病原体,裂解细胞.然后12000r/min离心5~10min,取上清20~30ul用于PCR扩增.血清标本可直加等体积的消化液,加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解液,95℃30min消化处理,离心取上清,PCR扩增检测HBVDNA. (三)碱变性法:取血清20ul,加入1mol/LNaOH20ul,37℃30min,离心
6、,加1mol/LHCl20ul,离心后,取上清5ul,用于PCR扩增.*亦有用10ul血清加NaOH至0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR,其特异性和敏感性较前法更好. (四)煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞,分泌物及血液标本,加适量无菌蒸馏水或PBS,混匀后,100℃煮沸10~15min,14000r/min10min,取上清做PCR. (五)碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10~100ul,加等体积的6MNaI,反复轻混20s,加等体积氯仿:异戊醇(49:1)振匀后,离心取上清加0.6体积的异丙醇,混匀后置
7、室温3min.14000r/min10min,沉淀加10~100ul,TE溶解,取5~10ul做PCR,亦有用100ul血清加裂解液300ul(6MNaI,0.5%十二烷基肌酸钠,10ug糖原,26mmol/LpH8.0Tris-HCL,13mmol/LEDTA)混匀后,60℃15min,加等体积异丙醇,离心沉定后,加TE液用于PCR扩增,其产量和质量较高. (六)异硫氰酸胍法 此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等. 1.异硫氰酸胍消化液 异硫氰酸胍4mol/L 柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L 十二烷基肌酸钠0.5
8、% β-巯基乙醇0.1mol/L 2.消化方法:用50~100ul细胞悬液及血清,加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀后,或65℃1小时
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