如何做好pcr(二)：pcr反应体系与反应条件

《如何做好pcr(二)：pcr反应体系与反应条件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、如何做好PCR(二)：PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液　10ul4种dNTP混合物　各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA　　　　0.1～2ugTaqDNA聚合酶　2.5uMg2+　　　　1.5mmol/L加双或三蒸水至　100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。　　引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利

2、用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：　①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。　②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端

3、碱基不配对而导致PCR失败。　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2-5U(指总反应体积为100ul时

4、)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，于-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物

5、的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体

6、的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度

7、点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性

8、有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，