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1、PCR反应体系中各种成分的作用不同模板浓度的实验结果用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行ＰＣＲ扩增,发现在模板量<25ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在25ｎｇ～200ｎｇ之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ｎｇ时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μｌ的ＰＣＲ反应体系中,模板ＤＮＡ以25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在200ｎｇ以下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍｇ2+的不良影响程度,应该尽
2、量降低ＤＮＡ模板用量。不同Ｍｇ2+浓度时实验结果设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为10ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增产物;Ｍｇ2+浓度为15～25ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加,ＰＣＲ扩增产物带型基本一致,但以20ｍＭ的扩增效果最好不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响设置5种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在01～02μＭ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0.2μＭ左右为宜。不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响采用2种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以4种不同的
3、ｄＮＴＰ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当ｄＮＴＰ浓度<200μＭ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μＭ的ｄＮＴＰ浓度为佳。ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响设置5个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在05ｕ～25ｕ浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以10～15ｕ结果较好不同退火温
4、度下的扩增效果引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响用同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较3种ＭｇＣｌ2浓度与3种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的9个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2在低浓度时,过量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+的螯合作用明显,表现为降低Ｍｇ2+的酶催作用,ＰＣＲ扩增产物减少或无,而低量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+酶催的抑制作用减少,Ｐ
5、ＣＲ扩增产物增多。在高浓度Ｍｇｃｌ2浓度下,ｄＮＴＰ无抑制作用。在相同Ｍｇ2+离子浓度和足量ｄＮＴＰ时,扩增产物相似。1-9泳道分别代表Ｍｇｃｌ2(ｍＭ)/ｄＮＴＰ(μＭ)的浓度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、3/300)。PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、
6、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引
7、物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓
