感受态细胞制备及各种感受态的特点.pdf

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1、精品文档感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl制备法，以下介绍CaCl制备法：221、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50mlLB液体培养基（

2、2瓶）中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注意：接种比例不得大于1:10。3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。4、4℃5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g2离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的

3、0.05mol/LCaCl-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬2液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。含15%甘油的0.05mol/LCaCl制备方法:2称取0.28gCaCl(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭2菌。感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA

4、直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。1。欢迎下载精品文档实验室常用的感受态细胞1.DH5α菌株克隆菌株：DH5α是一种常用于质粒克隆和高拷贝质粒的稳定复制的菌株。E.coliDH5α在使用pUC系列质粒载体转化时，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。RecA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。基因型：F-、φ80dlacZΔM15、Δ(lacZYA-argF)U169

5、、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA12.TOP10菌株克隆菌株：该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F-、mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80、lacZΔM15、△lacⅩ74、recA1、araΔ139Δ(ara-leu)7697、galU、galK、rps、(Strr)endA1、nupG3.BL21(DE3)菌株：蛋白表达菌株：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如

6、pET系列）的基因。该菌株用于T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的acUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白的表达。基因型：F-、ompT、hsdS（r-m-）、gal、dcm（DE3）BB4.BL21(DE3)pLysS菌株蛋白表达菌株：该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-、ompT、hsdS（

7、r-m-）、gal、dcm（DE3）、pLysS、CamrBB5.Rocetta感受态特征：蛋白表达菌株2。欢迎下载精品文档Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。（1）Rocetta（DE3）该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）对应的tRNA，这样Rocetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表

8、达水平。tRNA基因由它们的天然启动子驱动。基因型：F-、ompT、hsdSB(rB-mB-)、gal、dcm、lacY1(DE3)、pRARE(ar