黄连内生真菌分离培养条件筛选.doc

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1、黄连生真菌分离培养条件筛选摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。关键词：黄连，生真菌，分离条件，培养条件EndophyticfungiofCoptisseparationandcult

2、ureconditionsscreeningAbstract:Thetestselectthesuitablecultivationconditionofendophyticfungi,usingpressurestickmethodcultivateroots,stemsandleavesonPDAmediumatdifferentconcentrationsofsodiumhypochloriteanddifferentsurfacesterilizationtime.Recultivateallpartsa

3、fteracquisingsuitablecultivation,thenselectegecoloniesandrecultivatewhentheygrowfungi,thencirculatetheprocedure,untilgetpureculture.Bycultivatingandselectingtheroots,fibrousroots,petioleandleaves,morethan60kindsoffungiarefound,andisolatedstrainsarebreed,whic

4、hispreparationforsubsequentstrainsofidentification,thedeterminationofstrainsantimicrobialactivity.Keywords:Coptis,Endophyticfungi,Separationconditions,Cultureconditions黄连（CoptischinensisFranch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱[1]（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿酸等）。尤其是小蘖碱对人体病原

5、细菌和皮肤真菌[2]具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。Hirano,H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生[3]。黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）[4]、镇静作用、止泻作用、健胃作用[5]、对心脏心率[6]和心律作用等[7]。黄连及复方临床应用常用于治疗痢疾、急性肠胃炎、慢性腹泻、呼吸道感染、白喉、百日咳、结核性胞膜炎、萎缩性鼻炎、流行性结膜炎、化脓性中耳炎、口疮、牙周

6、炎、萎缩性胃炎、胃炎、胃及十二指肠溃疡、慢性胆囊炎等，近年来还研究发现黄莲具有较强的抗癌和降血糖功效。黄连药效作用广泛，历来为医家常用药材，而无节制的开放，野生资源已经枯竭，黄连栽培条件苛刻，生长周期长，难以满足医药生产的需要[8]。因此迫切需要寻找开发新的资源。大量的研究发现[9,10]，生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的次生代产物，是新化合物、新药物的潜在资源。开发和利用植物生真菌在保护植物物种资源、探索新的产物和新的活性以及提高活性成分的生产效率等方面都具有重要的价值。从目前已经研究过的植物来看，未发现没

7、有分离到生真菌的，因此可以推断出生真菌在植物是普遍存在的。生真菌-植物共生体[11]能产生多种次生代产物，用来抵御自然界的虫害，吸引有益微生物和传粉者，竞争和营养等。生真菌在植物体与外界环境的交流中发挥着重要的作用，为了增加对病原微生物的抵抗，他们产生新的抗菌素[12]，这些抗菌素具有环保，高效的特征，是新抗菌素的主要来源，也是生物控制的一个重要手段。将有益的生真菌接种于药用植物无菌苗的体，能够缩短组织培养周期，对植株的生长发育和生理代进行综合调节，促进宿主药用植物活性成分的合成和积累，提高有效成分的含量。此外，

8、还可以将有益的生真菌进行合理的优化组合，获得相应的“生真菌集群”[13]。目前，国外未见对黄连生真菌研究的报道，故笔者预研究我国黄连主产区——石柱的黄连的生真菌分离培养条件及菌株保存，为寻找含有与黄连相似或相同化合物的菌株打下基础。1材料与方法1.1试验材料新鲜无可见病斑的石柱黄连（C.chinensisFranch）的主根、须根、叶柄、叶片。1.2试验试剂青霉素；硫酸链