基因工程试验(综合).doc

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1、实验一大肠杆菌基因组DNA提取与检测　一、目的要求1．学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA；2.学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度二、基本原理　　本实验利用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。三、实验材料　　1.实验菌株：大肠杆菌TG12.实验试剂：LB液体培养基TaKaRaMiniBESTBacterialGe

2、nomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒无水乙醇3.实验仪器：移液枪，低温离心机，水浴锅，eppedorf管，振荡器四、操作步骤　　　1.大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的液体培养基中过夜培养。2.取1～4ml的过夜培养菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清。3.用150μl的SPBuffer（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4.加入20μl的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5分钟。5.加入30μl的EDTABuffer，均匀混合后室温静

3、置5分钟。6.加入200μl的SolutionA，剧烈振荡后65℃保温10分钟。注）①若SolutionA出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。②65℃保温10分钟后，溶液将由乳浊液变成透明液。如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解，基因组DNA将不能释放。7.加入400μl的SolutionB，剧烈振荡15秒。注）若SolutionB出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。8.加入650μl的SolutionC，上下颠倒均匀混合。9.12,000rpm离心1分钟。10.先弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）移入预先置于1.5ml离心管上的Filt

4、erCup中，12,000rpm离心1分钟。注）有机相（上层）请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。11.弃FilterCup，在滤液中加入450μl的DBBuffer，混合均匀。12.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。13.将上述操作11的混合液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。14.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。15.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认RinseB

5、中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。16.重复操作步骤15。17.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。18.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注）把水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。19.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。20.取5μlDNA洗脱液用琼脂糖电泳进行检测20.取10μ

6、lDNA洗脱液用分光光度计检测其浓度及纯度，其余-20℃保存实验二基于16SrRNA基因的PCR扩增、电泳和胶回收一、实验目的1.了解PCR扩增DNA的技术及原理；2.学习PCR扩增仪的使用；3.学习琼脂糖凝胶的制备和电泳方法；4.了解DNA胶回收的原理及方法。二、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，16SrDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrDNA是编码原核生物核糖体RNA小亚基1

7、6SrRNA的基因，长度为1540bp，相比较5SrRNA和23SrRNA而言，长度适中，又具有保守性和存在的普遍性，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对细菌进行测序分析。16SrDNA鉴定是利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA的提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，是一种快速获得细菌种