基因工程综合分析题

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1、综合题基因工程综合分析题1、种子在储藏过程中发生了某种变化，使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致的一个具有抗菌功能的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确，如何使种了重新获得对这种病的抗性？1、答：将敏感植株与抗性植株杂交后观察其后代的分离模式，判断功能的缺失与显性是否有关。通过mRN差异显示分析可鉴定敏感植侏与抗性植株基因组之间的表达差异。将获得的差示cDNA插入根癌农杆菌的Ti质粒，通过转化导入敏感植株中。这样即可通过反式互补获得目的的基因克隆。该基因可以作为分子探针，通过杂交分离出野生型和突变型的基因座，由此鉴定突变体的特性，最终可以通过“

2、基因治疗”的方式恢复抗性。2、一个人类疾病基因定位在7号染色体一段140kb的区域内，并已分离到此染色体区段的克隆，但是并不知道该基因定位在此区域的哪一位置。可用什么方法找到该基因？2、答：将140Kb的克隆片段分成一系更更小的片段，以每一个片段作为探针对其他哺乳动物的DNA进行动物印迹实验，种间保守的片段将出现信号；这些片段可能编码外显子。用外显子片段作为Southern印迹实验的探针来检测带病病人DNA，通常，遗传性疾病都是因为重要基因内的DNA发生了变化所致。如果病人的DNA与对照DNA的某一片段有着不同的杂交类型，那么这一片段很可能与疾病有关。从病人和正常对照组中分离RNA，用这一

3、片段作为探针进行Northern杂交。如果病人和对照组的RNA的总量不同，则这一片段很可能包含致病的基因。3、如何以大肠菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。3、答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：（1）细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动。（2）大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成熟Mrna。细菌细胞没有必要的机制来去除内含子。（3）有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩

4、下的两段肽链分别形成胰岛素的α、β链。（4）产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：①应该将激素的编序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近（含有这种序列的载体称表达载体）。②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起码密码ATC、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及1－2个终止密码：ATC――――编码序列――――TGATAG现在，这个合成基因可被插入载体中。③

5、有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有因难，可以用合成基因，从而免除加工过程。④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。说明：1）ATG、TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG，UGA的DNA序列。2）克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长素释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp长。4、用BamHI切割一重组质粒DNA分子并从中分离纯化了

6、两个DNA片段，一段长400bp，另一段长900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来，得到如图22．1所示的结果。于是将这两种片段混合起来，并在连接酶的存在下进行温育，分别在30分钟和8小时取样进行凝胶电泳分析，令人惊讶的是，连接产物并非是理想中的1．3kb的重组分子，而是一种复杂的片段模式（图22．2A）。同时发现随着温育时间的延长，较小片段的浓度逐渐降低，大片段的浓度逐渐增加。如果用BamHI来切割连接后的混合物，则起始的片段可以重新产生（图212．2A）从凝胶中分离纯化出1．3kb的片段，并取出一部分用BamHI进行切割，以检查它的结构。正如预料的一样，出现了两个原始的带（图22．

7、2B）。但是用EcoRI切割另一部分样品，希望能够产生两个300bp和一个长度为700bp的核苷酸片段，然而，凝胶电泳的结果，令人惊奇（图22．2B）（1）在原始连接混合物中为什么有如此多的带？（2）为什么用EcoRI切割纯化的1．3kb连接物会产生那么多的片段？4、答：（1）由于任意两个BamHI位点都可以连接在一起，产生的连接产物就很复杂。因此，0．4kb的片段连接一起可以产生诸如0.8kb、1.2kb、1.6kb、