博士德ELISA试剂盒一般操作流程.doc

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1、博士德ELISA试剂盒一般操作流程点击次数：744 作者：博士德发表于：2009-03-2616:03　转载请注明来自丁香园 已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。2.将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62

2、.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μι。3.酶标板加上盖，37℃反应90分钟。4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。5.将准备好的生物素抗人IL-2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。（TMB空白显色孔除外）。37℃反应60分钟。6.0.01MTBS或0.01MPBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。7.将准备好的ABC

3、工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应30分钟。8.0.01MTBS或0.01MPBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。9.按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应8-12分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。10.按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。11.用酶标仪在450nm测定O.D.值。显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：opt

4、icaldensity）记录。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果（博士德网站有下载）有两种设定空白对照的方案：（1）将TMB空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。（2）将零孔设为对照。得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。12.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。