质控菌种管理规定

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1、质控菌种管理规定微生物实验用菌种是进行新产品研发和生产质量控制的标准物质。为了保证微生物实验的准确灵敏和人员及环境的卫生安全，特制定以下规定：1.菌种采集。实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买ATCC菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均由公司统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。2.菌种的活化：购买的标准菌种必须要求是冻干粉，科研中菌种交流可以为斜面或液体。菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。具体使用培养基的情况如下表，详细菌种使用方法见附表

2、：方  法      培养基方法1      胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，非选择性羊血琼脂，PCA或营养琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。方法2      非选择性羊血琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。方法3      巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养24-48小时。方法4      CDC厌氧血琼脂35℃厌氧培养48-72小时；部分专性厌氧菌能需要5-7天，才能充分生长；对于梭菌，以下新鲜培养基也可选用：营养琼脂，TSA琼脂，PCA琼脂，需培养48-96小时。方法5      沙堡氏葡萄糖Emmons琼脂25-28℃培养3-7天；也可用PDA琼脂。方法6    

3、  巧克力琼脂平板，35℃微需氧环境培养48-72小时。方法7      改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂，35℃5-10%CO2或正常环境培养7天。方法8      缓冲活性碳酵母提取物琼脂，35℃正常环境培养3-5天。方法9      巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养48小时。方法10      先用脑心浸出液肉汤或TSB培养基35℃增菌培养18-24小时，再划线至TSA琼脂35℃正常环境培养24-48小时。方法11      先接种于MRS肉汤35℃增菌培养24-48小时，再划线接种至含羊血的哥伦比亚CNA培养基35℃5%CO2环境培养24-48小时。方法12 

4、     PDA琼脂45℃正常环境培养48-72小时。方法13      先接种于10B精氨酸肉汤，作系列梯度稀释35℃正常培养至培养基变成粉红色，接入A-8琼脂。3.菌种保存。所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有本公司的检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法）；具体菌种保存方法如下：3.1干粉菌种：购买的干粉菌种保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。3.2斜面菌种或液体菌种：3.2.1液氮罐保存方法：用于第一代菌种的长期保存，每种菌种保存5管。（1）准备用于

5、液氮保藏的安瓿管或菌种保存管(塑料)，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。　　（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，121℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用121℃灭菌15分钟。　　（3）接入菌种：将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有

6、保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。　　（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。　　（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。　　（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌

7、、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。3.2.2液体石蜡保存法：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生