外植体褐变及解决措施.doc

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1、外植体褐变及其解决措施植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在，与菌类污染和玻璃化现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了全面分析，并针对这些因素提出了相应的解决措施。褐变是指外植体在培养过程中，自身组织向表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。一、褐变产生的机理1.非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基

2、部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了。2.酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3

3、类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。二

4、、褐变产生的影响因素1.植物种类及基因型 不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶（PPO）活性的差异有关。木本植物和单宁含量高的植物都容易褐变，一般木本植物比草本植物更容易发生很扁现象，如鹅掌楸、油茶等，褐变现象非常明显。2.材料的年龄和生理状态  许多实验表明，幼龄材料酚类物质含量少，褐变现象较轻；成龄材料酚类物质含量较多，容易发生褐变。3.取材时间和部位 由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生长季节不相同，一般在生长季节，酚类物质含量增加，多酚氧化酶的活性也逐渐增强，褐变

5、现象回严重很多，因而一般都选在早春或秋季取材。同一外植体不同取材部位，褐变程度不同，如苹果、石竹、菊花，选择顶芽比侧芽，褐变程度低，更易成活。王异星用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。因此，取材时应选择褐变程度轻的部位。4.外植体的大小    一定程度上，外植体材料越小越容易发生褐变，相对较大的材料出现褐变程度较轻。5.外植体材料受伤程度外植体材料受伤会加剧褐变的发生。取材时，应用锋利的器械，尽可能减少受伤面积，

6、以减轻褐变的发生。此外，外植体表面消毒时所用的化学消毒剂及较长的灭菌时间也会加重褐变现象。6.培养条件 温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。7.培养基成分 培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。三、防止外植体产生褐变的对策适当外植体的选择取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。对外植体的处理通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下

7、：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。选择适当的培养基1）适当的无机盐浓度 张妙霞等在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养