果胶酶产生菌的筛选及其条件优化2.doc

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1、实验序号实验7实验名称特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究（一）实验时间2011.11.15--12.15实验室118一、实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会运用微生物生态知识分离产酶微生物；3、掌握果胶酶活性测定的原理，学会果胶酶活性的测定方法；4、了解酶学性质的研究。二、实验原理1、果胶质：果胶是植物中的一种酸性多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍带酸味，具有水溶性，工业上即可分离，其分子量约5万——30万，主要存在于植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。果胶质是一类高分子碳水化合物，普

2、遍存在与高等植物的细胞壁及细胞壁间作为结构物质。2、果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌都可以发酵产生果胶酶，但是目前商品果胶酶主要来自于霉菌。果胶酶主要用于果胶的分解，在水果的加工、葡萄酒的生产、麻类脱胶和饲料方面。3、果胶酶的酶活测定方法：①、粘度降低法：利用粘度计测量一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘

3、度降低值。②、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。③、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。④、还原糖法（DNS法）：测定在一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。4、影响微生物发酵的因素有很多；①、培养基的成分（营养物质及其浓度）例如：碳源的种类、氮源的种类、碳源的浓度、氮源的浓度、无机盐、水含量等；②、菌种接种的量；③、发酵条件：温度、

4、PH、溶解氧等；④、附加条件：诱导物、表面活性剂等（5）、酶催化反应的进行也受到多方面因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂、抑制剂。（6）、果胶酶的最适催化PH为酸性，在3.5左右，而DNS的显色PH为碱性。三、实验设备及材料：1、实验设备：天平、灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、恒温水浴锅、计时器（精确到秒）、分光光度计、离心机、烘箱、PH计数器。2、实验用具：烧杯、三角瓶、试管、移液枪（枪头）、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵、试管架、玻璃棒、纱布、绳子、离心管、比色皿、培养皿。3、实验试剂：①、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652克，柠檬酸钠7.5克，溶解定

5、容至1000ml，用0.1MNaOH或0.1MHCl调节PH至3.0。②、底物——0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用PH=3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，在电磁炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4℃，7天内有效。③、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500mL水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入2，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后过滤使用。4、实验材料：从周围环境采集的土样或腐烂的水果上的霉菌。5、培养基：①、基本培养基；成分及条

6、件果胶磷酸二氢钠蛋白胨琼脂pH含量及水平1%0.5%1%2.0%4.5②、分离培养基；成分及条件果胶磷酸二氢钠琼脂pH含量及水平0.5%0.5%2.0%4.5③、发酵培养基；成分及条件果胶磷酸二氢钠蛋白胨pH含量及水平1%0.5%1%4.5④、种子培养基；成分及条件麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖磷酸二氢钾pH含量及水平3.0%2.0%0.5%1%0.1%4.5⑤、固体发酵培养基；成分及条件麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖水含量及水平10g2.5g0.1g0.125g15mL四、实验步骤（一）、半乳糖醛酸标准曲线的绘制；1、先配制一系列浓度不同的标准曲线溶液，用选定的显色剂进行显色。（1）、精确称取0.1

7、00g半乳糖醛酸，用缓冲液定容至100mL，制得浓度为1mg/mL的半乳糖醛酸的标准溶液。（2）、如下表配制溶液；半乳糖醛酸溶液体积0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液(ml)2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积(ml)20202020202020OD(540nm)0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.850（3