血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验备课讲稿.ppt

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1、实验二（P124）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳（Celluloseacetatemembraneelectrophoresisofserumproteins）实验目的1、掌握电泳法分离蛋白质的原理2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和操作方法3、学习蛋白质染色的方法分离蛋白质的方法分离方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法电泳法薄膜电泳等电聚焦电泳聚丙烯酰胺电泳离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析实验原理电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而

2、带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。以蛋白质为例：H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH

3、0,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20缓冲液pH=8.6pI＜pH血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15mm染色剂一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色实验操作1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并

4、吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。2.电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成滤纸桥。3.点样：点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边1.5cm处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）

5、点样区6.5cm1.5cm4.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，恒压110V，打开电源开关，电泳时间60min。电泳后，调节旋钮使电压为零，关闭电泳仪切断电源。5.染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时可置于摇床，均匀摇晃。6.漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗3次，每次5min,直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹风机冷风吹干或者自然

6、晾干。8.记录和分析实验结果透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜可作扫描或照相。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样原点注意事项1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量以不干不湿为宜。3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4、点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多或过少。

7、5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。思考题1.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？2.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义可能相关疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*肾病综合症↓↑*↑*肾炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝坏死↓*↑↑↑↑传染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎症/感染后期↑*低球蛋白血症↓*