免疫胶体金技术课件.ppt

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1、胶体金免疫技术colloidalgoldImmunetechnique许贇兴2018年3月胶体金标记技术的相关定义胶体金免疫技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体反应的一种新型的免疫标记技术。胶体金是指金盐在还原剂作用下还原成金原子，聚合成一定大小（呈色不同）的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。免疫金实质上是胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物。胶体金颗粒带电情况抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVDTechnology）Synthesisandpropertiesofdifferentparticlesize胶体金粒径(nm)1%柠檬酸三钠加入量(ml)胶体金特性呈

2、色λmax162橙色518nm24.51.5橙色522nm411红色525nm71.50.7紫红535nmAdjustthegoldcolloidtotheproperpH胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。胶体金技术的种类及优点快速免疫金渗滤法(immuogoldfiltrationassay,IGFA)——斑点金免疫渗滤试验即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑

3、料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒顺序：标本——免疫金——洗涤液阳性：红色斑点间接法：包被抗原，少用免疫层析法(immunochromatogra-phy，ICA)是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流（lateralflow）)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者

4、抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。双抗体夹心法、竞争法、间接法胶体金免疫层析法试剂的组成样品垫(Samplepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；调节样品液pH值或粘度等。结合垫(Conjugatepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：-吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移

5、到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：推荐使用Millipore，MDI，S&S，whatman等国外公司的硝酸纤维素膜。NC膜的作用：-在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。片材：不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。吸收垫(AbsorbentPad)：提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率

6、的吸收纸；吸收纸的作用：主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。免疫胶体金技术的特点优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染。GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。成为目前“床旁检验”（point-of-caretesting，POCT）中广为应用的方法。不足：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检

7、测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。THANKSANDBLESSINGHaveagoodtime,enjoyyourself!