免疫胶体金组化技术

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1、第十讲免疫胶体金组化技术主要内容一、免疫胶体金技术发展史二、溶胶的基本概念三、胶体金的制备方法四、胶体金探针制备五、光镜免疫金银组织化学思考题：1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？3.制备胶体金的还原剂有哪几种？4.有哪几种经典的胶体金制备方法？5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他们的过程？6.免疫金间接法与PAG放大法有何区别？7.IGS和IGSS技术的优点有哪些？8.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？9.IGS与IGSS有何区别？一、免疫胶体金技术发展史1.1939年Kausche和R

2、uska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。2.1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接IHC检测沙门菌的表面抗原。3.1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染色法。同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗粒的免疫金银染色方法（Immunogold-silverstaining,IGSS）。6.1986

3、年Fritz等人在IGSS法基础上成功地进行了彩色IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。二、溶胶的基本概念1.胶体金溶胶的概念：溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。(1)离子分散体系分散相以小分子或离子状态存在（分散相粒子小于1nm）。具有高度的稳定性。(2)胶体金分散体系指分散相颗粒在1～100nm之间，外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见。(3)粗分散体系指颗粒大于100nm，不稳定，显微镜下可见。2.胶体金的一般性状(

4、1)胶体金的颜色颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红葡萄酒色；20～40nm之间吸收波长530nm，呈深红色；60nm的金溶液主要吸收波长600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。(2)胶体金的稳定性其稳定介于小分子离子和粗分散体系之间，即稳定，又容易出现聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力；②胶粒及其溶剂化层的带电情况；③胶体界面的溶剂膜。(3)溶胶的聚沉现象胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：①少量电解质对溶胶的作用；②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减

5、少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；③浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。三、胶体金的制备1.制备前的准备(1)玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。其清洁流程如下：清洁液泡24h，自流水洗净，洗洁剂洗3～4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗4～5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。(2)试剂的配制要求所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。2.胶体金制备的方法胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还

6、原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。(1)改良的白磷还原法(Henegouwen,1986)①取20％饱和度白磷乙醚溶液0.5ml，加蒸馏水60ml。②加入1％的HAucl4水溶液0.75ml，加0.1mol/LK2CO30.6ml，振荡变成棕色。③加热煮沸，至透明红色。胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系还原次数颗粒直径(nm)正负误差15.60.926.70.937.90.949.81.35121.0(

7、2)柠檬酸三钠还原法(Frens1973)取0.01%氯化金溶液100ml加热至沸腾，迅速中入4ml1％柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系0.01%HAucl41％柠檬酸三钠(ml)直径(nm)1005.010.01004.015.01001.525.01001.050.01000.7560.01000.6070.01000.4298.01000.32147.01000.25160(3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot1985)A液：1％氯化金1ml蒸馏水79mlB液：1％柠檬酸三钠4ml

8、1％鞣酸0.1ml25mmol/LK2CO30.1ml蒸馏水15