免疫组化技术

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1、免疫组化技术免疫组化免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组化的原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成

2、分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。实验所用标本实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究。实验所用的抗体免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应

3、用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。免疫组化的作用组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。免疫组化的特点特异性强敏感性高定位准确、形态与功能相结合免疫组化操作步骤一.石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲

4、洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%

5、酒精浸泡2h后擦干→涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法1、脱蜡、水化60℃×20min→Xylene2×10minutes；60℃×20分钟→二甲苯2×10分钟100%absoluteethanol：2×5minutes；100%的绝对乙醇:2×5分钟;95%ethanol2minutes；95%的乙醇2分钟80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；蒸馏水:

6、5分钟PBS洗3次×3min。2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶用封闭通透液浸润切片30min（RT避光）。配法是用预热40mlPBS加120ulTritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂）加热几分钟后，临用前加400ul30％H2O2。PBS溶液洗3次×3min。3、抗原修复暴露抗原决定族切片放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4min至沸腾后，再加热约6min×4次，每次间隔补足液体，防止干片4、封闭非特异性蛋白PBS溶液洗3次×3min；将切片取出,周围水分用滤纸

7、吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；5、一抗孵育甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37℃复温45min。6、二抗孵育将一抗倒掉并用PBS洗5min×5次；用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37℃恒温烤箱中30min（回收）。用PBS洗5次×5min；7、SP反应加入SP后放入37度烤箱中3

8、0min。用PBS洗5次×5min；8、显色加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5min（3～10min），由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光）（1:20储备液）：5ul20×DAB＋0.1ul30%H2O2＋95ulPBS。1%DAB储备液的配制:50mgDAB+5ml0.05mol/LPBS充分溶解，-20℃保存。9、复染、脱水、透明、封片用PBS3次×3min后，用双蒸水洗5min；加一大滴苏木