免疫组化技术62633

《免疫组化技术62633》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、免疫组织化学技术山东大学医学院组胚教研室史玮四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）免疫组织化学技术（免疫组化）免疫印迹技术（Westernblot）细胞培养技术局限性联合应用免疫组织化学技术免疫组化免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。抗原（antigen）：蛋白质具有抗原性。抗体（antibody）：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白

2、Immunoglobin（Ig）。免疫组化技术的分类按标记物质的种类如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。基本原理抗原一抗+二抗标记的抗原抗体复合物一抗免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记物与抗体集合形成标记抗体标本的处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜下观察

3、结果常用标本的获得组织标本和细胞标本两大类石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片细胞爬片和细胞涂片免疫组化对组织和细胞标本的要求：保持所检标本原有的结构、形态；在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。标本的处理标本的获得标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常

4、交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。避开坏死区：细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。标本的固定与保存目的：使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免在染色和反复清洗的过程中抗原失活或弥散。好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应常用固定剂常用固定液：固定剂品种

5、很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）醇类（常用乙醇）其它（丙酮）常用固定剂甲醛(福尔马林)应用最广原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。常用固定剂组织块不宜过厚。缩短固

6、定时间。降低固定温度。改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.40.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。固定后充分水洗以减少分子间交联。切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。常用固定剂多聚甲醛(常用4%)：用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。戊二醛：穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。常用固定剂常用固定剂

7、乙醇（最常用）原理：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。优点：穿透性强、抗原性保存好。缺点：脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。常用固定剂丙酮：对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本。冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单较好的保存组织的抗原免疫活性，避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可

8、能会使抗原弥散切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮组织学切片制作石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法较好的保持组织细胞的形态结构切片有连续性长期存档，供回顾性研究由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。抗原的保存量不如冰冻切片。组织学切片制作抗原修复化学方法：胰蛋白酶、胃蛋白酶加热方法水浴加热法微波照射法高压加热法抗原修复化学方法:主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用