免疫组化技术课件

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1、免疫组织化学技术（immunohistochemistry）概念:指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法基本原理通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原—抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。组织抗原抗体标记物标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标组织抗原免疫

2、细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合物间接法直接法两种免疫细胞化学反应方法组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法应用组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作切片的制作组织的固定组织石蜡包埋切片目的:使细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。组织材料的固定影响固定的因素1.温度一般固定液固定效果随温度升高而加强，以室温22℃为常用。2．浓度

3、10％中性甲醛，4％多聚甲醛固定液3.固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。组织固定后，必须彻底冲洗以去除固定液组织的脱水脱水就是用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程。不同的组织应分开脱水，特别是对一些易脆的组织（肝、脾等）应严格掌握脱水时间。动物组织的脱水时间应比人体相应标本时间短脱水应按照从低浓度到高浓度的过程。组织的透明、浸蜡、包埋组织透明的目的是便于浸腊包埋组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水不良以及透明剂的纯度不够。最常用的透

4、明剂为二甲苯浸蜡包埋是使蜡进入到组织中使其变硬便于切片。蜡的熔点一般为56-58℃。包埋蜡的温度应与组织块温度接近。大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％乙醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min,石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、

5、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。组织石蜡包埋切片载玻片的清洁：清洁液浸泡24小时后依次自来水、双蒸馏水洗，95%酒精浸泡2小时，擦拭干净。如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。切片粘合剂的使用：多聚赖氨酸（分子量200KD）：0.05%浓度，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥备用。切片：石蜡切片：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)60℃烤片3-8h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(

6、6)切片可在4℃保存数年冰冻切片：细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。抗原暴露和修复石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定剂甲醛使蛋白质发生凝固,在发生凝固的过程中

7、可引起自身和不同蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联,导致蛋白质三级或四级结构的折叠方向发生改变,并形成网络状结构而掩盖抗原决定蔟。染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要抗原暴露和修复，可使抗原决定簇重新裸露。抗原暴露和修复常用方法有二种,一是用酶消化,二是用热处理(微波辐射法、高压法及隔水加热法)直接加热法最常用,操作方法是将介质溶液用烧杯在电炉上加热至100℃,放入切片并保持95～100℃20min,在室温中自然冷却20min即可。热修复热介质0.01mol/LPH6.0柠檬酸缓冲液,最常用。微波辐射

8、抗原修复法：①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。③自来水洗，蒸馏水洗。④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟。⑤待修复液自然降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。高压抗原修复法：