课题3-血红蛋白的提取和分离.docx

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1、课题3血红蛋白的提取和分离课题背景蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作;血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。凝胶颗粒在色谱柱中装填得十分紧密。图5-13为了清楚地表示分离过程，有意将凝胶颗粒画得稀疏。基础知识蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性

2、质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。在本课题中，我们将学习蛋白质分离方法中的凝胶色谱法。（一）凝胶色谱法凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离（图

3、5-13）。a.相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进人凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。b.(1)蛋白质混合物上柱；(2)洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进人凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；(3)相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；(4)相对分子质量不同的分子完全分开；(5)相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。v凝胶颗粒在色谱柱中装填得十分紧密。图5-13为了清楚地表示分离过程，有意将凝胶颗粒画得稀疏。（二）缓冲溶液缓冲作用

4、在日常生活中并不少见。例如，运动鞋的鞋底富有弹性，能够缓冲外力，减少运动员受伤的几率（图5-14）。那么，缓冲溶液的缓冲作用体现在哪里呢？在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。（三）电泳电泳是指带电粒子在电场的作用

5、下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动（图5-15)。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N'-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶（图5-16）。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶

6、中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同会有很大差异。在本课题中，我们以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离血红蛋

7、白的方法。（一）样品处理及粗分离血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以外，约90%是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成（图5-17），包括两条α-肽链和两条β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。本课题可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。v为防止血液凝固，在采血容器中要预先加